Реферат: Определение активности ферментов
Российский химико-технологический Университет
им. Д.И.Менделеева
Кафедра промышленной биотехнологии
МЕТОДИЧЕСКАЯ РАБОТА
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ
Выполнила: студентка
группыЭ-35
ТимошкинаЕ.А.
Преподаватель:
МартимьяноваН.А.
Москва,1996 г
СОДЕРЖАНИЕ
Свойстваферментов как биологических катализаторов. 1
Получениеферментных препаратов. 4
Общие методыопределения активности ферментов. 6
Методыопределения активности протеолитических ферментов 11
Литература 19
/>/>/>/>/>/>/>/>Свойстваферментов как биологических/> катализаторов.
Фермент — от лат.fermentum — закваска; знзим — от греч. эн — внутри, зиме — закваска.
Ферменты, илиэнзимы, — это катализаторы белковой природы, образующиеся и функционирующие вовсех живых организмах. Происхождение терминов связано с тем, что первоначальноферментативные процессы были открыты и изучены в бродильном производстве. Вкаждой клетке имеются сотни различных ферментов. С их помощью осуществляются многиехимические реакции, которые могут с большой скоростью идти при температурах,подходящих для данного организма, т.е. в пределах от 5 до 400 С.Чтобы эти реакции с той же скоростью протекали вне организма, потребовались бывысокие температуры и резкие изменения некоторых других условий. Для клетки этоозначало бы гибель, так как вся работа клетки строится таким образом, чтобыизбежать любых сколько-нибудь заметных изменений в нормальных условиях еесуществования. Следовательно, ферменты можно определить как биологическиекатализаторы, т.е. как вещества, ускоряющие реакции. Они абсолютно необходимы,потому что без них реакции в клетках протекали бы слишком медленно и не моглиподдерживать жизнь. Совокупность биохимических реакций, катализируемыхферментами, составляет сущность обмена веществ, являющегося отличительнойчертой всех живых организмов. Через ферментативный аппарат, регуляцию егоактивности происходит и регуляция скорости метаболических реакций, ихнаправленности.
Являяськатализаторами, ферменты имеют ряд общих с небиологическими катализаторамисвойств:
1. Ферменты не входят в составконечных продуктов реакции и выходят из нее, как правило, в первоначальномвиде, т.е. они не расходуются в процессе катализа (в настоящее время доказано,что некоторые ферменты в конце химической реакции подвергаются модификации идаже распаду, а не освобождаются в неизменном виде, как постулировалЛ.Михаэлис).
2. Ферменты не могут возбудитьте реакции, протекание которых противоречит законам термодинамики, они ускоряюттолько те реакции, которые могут протекать и без них.
3. Ферменты не смещаютположения равновесия, а лишь ускоряют его достижение.
Специфическиесвойства:
1. Конечно же, по своемухимическому строению все ферменты являются белками.
2. Эффективность ферментовнамного выше, чем небиологических катализаторов (скорость протекания реакциипри участии фермента выше на несколько порядков).
3. Ферменты обладают узкойспецифичностью, избирательностью действия на субстраты, т.е. на вещества,превращение которых они катализируют. Высокая специфичность ферментовобусловлена конформационной и электростатической комплементарностью междумолекулами субстрата и фермента и уникальной структурой активного центрафермента, обеспечивающими “узнавание”, высокое сродство и избирательностьпротекания одной какой-либо реакции из тысячи других химических реакций,осуществляющихся одновременно в живых клетках.
В зависимости отмеханизма действия различают ферменты с относительной (или групповой)специфичностью и абсолютной специфичностью. Так, для действия некоторыхгидролитических ферментов наибольшее значение имеет тип химической связи вмолекуле субстрата. Например, пепсин расщепляет белки животного и растительногопроисхождения, хотя они могут существенно отличаться друг от друга как похимическому строению и аминокислотному составу, так и по физико-химическимсвойствам. Однако пепсин не расщепляет углеводы или жиры. Объясняется это тем,что местом действия пепсина является пептидная -СО-NH- связь. Для действиялипазы, катализирующей гидролиз жиров на глицерин и жирные кислоты, такимместом является сложноэфирная связь. Аналогичной относительной специфичностьюобладают также некоторые внутриклеточные ферменты, например гексокиназа,катализирующая в присутствии АТФ фосфорилирование почти всех гексоз, хотяодновременно в клетках имеются специфические для каждой гексозы ферменты,выполняющие такое же фосфорилирование.
Абсолютнойспецифичностью действия называют способность фермента катализироватьпревращение только единственного субстрата. Любые модификации в структуресубстрата делают его недоступными для действия фермента.
Стереохимическаяспецифичность ферментов обусловлена существованием оптически изомерных L- иD-форм или геометрических (цис- и транс- ) изомеров химических веществ. “Так,известны оксидазы L- и D-аминокислот, хотя в природных белках обнаружены толькоL-аминокислоты. Каждый из видов оксидаз действует только на свой специфическийстереоизомер.
+ЅО2
L-аминокислота />кетокислота+ NH + H2O
оксидаза L-аминокислот
+ЅО2
D-аминокислота />кетокислота+ NH + H2O
оксидаза D-аминокислот
Наглядным примеромстереохимической специфичности является бактериальная аспартатдекарбоксилаза,катализирующая отщепление СО2 только от L-аспаргиновой кислоты спревращение ее в L-аланин” [1].
4. Регулируемость ферментов какбиокатализаторов. “Через регуляцию ферментативного аппарата осуществляетсяскоординированность всех метаболических процессов во времени и пространстве,направленное на воспроизведение живой метерии, поддержание постоянствавнутриклеточной среды, на приспособление к меняющимся внешним условиям” [2].
5. Термолабильность ферментов.Скорость химических реакций зависит от температуры, поэтому катализируемыеферментами реакции также чувствительны к изменениям температуры. Однаковследствие белковой природы фермента тепловая денатурация при повышениитемпературы будет снижать эффективную концентрацию фермента с соответствующимснижением скорости реакции. Таким образом, термолабильность, иличувствительность к повышению температуры является одним из характерных свойствферментов, резко отличающих их от неорганических катализаторов. При 1000Спочти все ферменты утрачивают свою активность (исключение составляют, очевидно,только один фермент мышечной ткани — миокиназа, которая выдерживает нагреваниедо 1000С). При низких температурах (00С и ниже) ферменты,как правило, не разрушаются, хотя активность их падает почти до нуля. Во всехслучаях имеет значение время воздействия соответствующей температуры. Внастоящее время для пепсина, трипсина и ряда других ферментов доказаносуществование прямой зависимости между скоростью инактивации фермента истепенью денатурации белка. На термолабильность ферментов определенное влияниеоказывают концентрация субстрата, рН среды и другие факторы.
6. Зависимость активностиферментов от рН среды. Ферменты обычно наиболее активны в пределах узкой зоныконцентрации водородных ионов, соответствующей для животных тканей в основномвыработанным в процессе эволюции физиологическим значением рН среды 6.0 — 8.0.рН-оптимум действия ферментов лежит в пределах физиологических значений.Исключение составляет пепсин, рН-оптимум которого равен 2.0. Объясняется этотем, что пепсин входит в состав желудочного сока, содержащего свободную солянуюкислоту, которая создает оптимальную кислую среду для действия этого фермента.С другой стороны, рН-оптимум аргиназы лежит в сильно щелочной зоне (около10.0); такой среды нет в клетках печени, следовательно, in vivo аргиназафункционирует, по-видимому, не в своей оптимальной зоне рН среды. Влияниеизменений рН среды на молекулы фермента заключается в воздействии на состояниеи степень ионизации кислотных и основных групп (СООН-группы дикарбоновыхаминокислот, SH-группы цистеина, имидазольного азота гистидина и др.). Приразных значениях рН среды активный центр может находиться в частичноионизированной или в неионизированной форме, что сказывается на третичнойструктуре белка и соответственно формировании активного фермент-субстратного комплекса.Кроме того, имеет значение и состояние ионизации субстратов и кофакторов.
/>/>/>/>/>/>/>/>Получениеферментных препаратов.
Для получения ферментныхпрепаратов используют как микроскопические грибы, так и бактерии и дрожжи.Иногда получение технического ферментного препарата кончается проведениемпроцесса ферментации, например, в спиртовой промышленности для осахариваниякрахмала используют жидкую культуру Aspergillus niger. Впоследствии еедобавляют в жидком виде в количестве 10-12% к осахареваемому затору. Однакоактивность ферментов в культуральной жидкости быстро снижается. Поэтому широкопрактикуют получение сухих технических ферментных препаратов.
Технические препаратыферментов. Комплексный амилолитический ферментный препарат получают путемвыращивания плесневых грибов на твердой питательной среде с последующей сушкойи измельчением полученной массы. Более активный препарат фермента получаютпутем экстракции такого “грибного солода” с последующим выпариванием и сушкой.Еще более активные ферментные препараты можно выделить из культуральнойжидкости путем осаждения амилазы ацетоном и дальнейшим высушиванием коагулятомпри температуре 27-270С. Для осаждения фермента часто используют исульфат аммония. Предварительно культуральную жидкость выпаривают притемпературе 400 С до 40%-ного содержания сухих веществ. Коагулятсушат вместе с наполнителем.
Комплекс ферментовпротеолитического и амилолитического действия получают при помощи культурыBacillus subtilis. Это аэробные, грамположительные, подвижные палочки. Для этихбактерий характерен очень богатый комплекс гидролитических ферментов. Вкачестве источников питания они могут использовать белки, углеводы, спирты,органические кислоты. Bacillus subtilis культивируют как методом поверхностногокультивирования на отрубях, так и в жидких средах особого состава по методуглубинного культивирования.
Целлюлолитическиеферментные препараты. Производство целлюлаз основывается на использованиикультуры гриба Trichoderma viride. Существующие в настоящее время способыполучения целлюлаз в глубинной культуре предполагает выращиваниемикроорганизмов-продуцентов целлюлаз на питательной среде, содержащей вкачестве источников углерода, как правило, очищенную целлюлозу, или жесодержащие ее природные субстраты. Но получение целлюлазы с использованием вкачестве основного компонента среды природной целлюлозы (например, древесныеопилки) сопряжено с рядом технологических трудностей. Более рациональноиспользование питательной среды, содержащей растворимый “индуктор”. Такойпитательной средой может быть молочная сыворотка, основным компонентом которойявляется лактоза (предварительно от молочной сыворотки отделяют белок). Вкачестве продуцента может быть использован гриб Trichoderma lignorum,позволяющий получить весь комплекс целлюлолитических ферментов, необходимыйдля расщепления природных целлюлозусодержащих субстратов.