Реферат: Гемоглобин эритроцитарных мембран человека

содержание

1.ВВЕДЕНИЕ

2.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

3.МАТЕРИАЛ ИМЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1.Материалисследования

3.2.Методыисследования

4.РЕЗУЛЬТАТЫСОБСТВЕННЫХИССЛЕДОВАНИЙ

4.1.Количественноесодержаниегемоглобинаи основныхбелков мембранэритроцитовчеловека.

4.2.Взаимноеварьированиеколичественнойпредставительностиотдельныхбелков эритроцитовчеловека.

4.3.Обсуждение

5.ЗАКЛЮЧЕНИЕ

6.ВЫВОДЫ

7.СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение

Мембранаэритроцитав течение долгоговремени представляласьисследователямлишь оболочкой, отделяющейгемоглобинот плазмы. Рольмембраны вфункционированииэтой высокоспециализированнойклетки, казалось, ограничиваетсятолько способностьюбыть проницаемойдля газов крови.Однако успехи, достигнутыев мембранологииза последниегоды и, в частности, изучении мембраныэритроцитамлекопитающихс помощьюбиохимическихи биофизическихметодов, заставляютв настоящеевремя по-иномувзглянуть нароль мембраныв работе клетки.Совокупностьимеющихся влитературеданных позволяетсделать выводо том, что плазматическаямембрана эритроцита– важнейшийэлемент клетки; она одновременноявляется имеханическойоболочкой срегулируемымифизическимисвойствами, и «диспетчерской»клетки, осуществляющейкоординациюработы клеткив зависимостиот физическихи химическихсигналов, поступающихк ней в организме.[9]

Важнейшиекомпонентыбиологическихмембран – белки, которые осуществляютих специфическиефункции. Однииз них обеспечиваюттранспортопределенныхмолекул внутрьклетки или изнее, другиеявляются ферментамии катализируютассоциированныес мембранойреакции, третьиосуществляютструктурнуюсвязь цитоскелетас внеклеточнымматриксом илислужат в качестверецепторовдля полученияи преобразованияхимическихсигналов изокружающейсреды. Мембранныебелки, образующиецитоскелет, соединяютсядруг с другомспецифическимдля каждоготипа клетокобразом и формируютсложные динамическивзаимодействующиемежду собойструктуры. Этиструктуры иотвечаютнепосредственноза согласованноеповедениечастей клеток.[4] Гемоглобинможно считатьсвоего родамодельнымбелком, структура, свойства ифункции которогонаиболее полноизучены посравнению сдругими белкамина протяжениипоследних 50лет. Десяткилет исследованийгемоглобинаво многихлабораторияхмира привелик значительномупрогрессу вописании ипониманиифизических, химическихи биологическихаспектов егофункционирования.[2] Однако, несмотряна это, в научнойлитературенедостаточноподробно освещенвопрос о связигемоглобинасо структурнымибелками эритроцитарныхмембран.

Изучениеструктурымембраны эритроцитачеловека ипрежде всеговходящих в ихсостав белковявляется актуальным, поскольку ряднаследственныхпатологий(сфероцитарныеанемии, миодистрофии, некоторыезаболеванияцентральнойнервной системы)характеризуютсяразличныминарушениямив белковойкомпонентеэритроцитарноймембраны и какследствиенарушениемее структурно-функциональнойорганизации.[7] Определенныефакторы средымогут изменятьэкспрессиюгенов, что отражаетсяна жизнедеятельностикак отдельныхорганов и систем, так и организмав целом. Некоторыеавторы рассматриваютуровень гемоглобинав крови какуниверсальныйнеспецифическийпоказательадаптационныхпроцессов, процессовнапряженностиорганизма вответ на различныевнешние воздействия.[1] Так, следствиемдействия такихфакторов можетявиться уменьшенияколичествагемоглобинав крови илинарушенияструктурно-функциональнойорганизациибелковой компонентымембран эритроцитов.Результатомтаких измененийслужит рядпатологий, и, как следствие,- значительноеснижениеадаптационныхвозможностейчеловека. Поэтомуна сегодняшнийдень актуальноизучение структурымембрансвязанногогемоглобина, оценка егоколичественногосодержанияи взаимосвязьсо структурнымибелками эритроцитарныхмембран. В связис начавшимсясистематическимизучениемпродуктовэкспрессиигенов человекав рамкахмолекулярно-анатомическогонаправленияпредставляетсякрайне важнымустановлениеколичестваи основныхсвойств полипептидов, входящих всостав мембраныэритроцита, и составлениекаталога белков.Возможностиэтих исследований, а также поискапервичногобиохимическогодефекта принаследственныханомалияхсущественновозросли послеширокогораспространенияметода двухмерногоэлектрофорезав полиакриламидномгеле (ПААГ). [7]

Цельюнастоящегоисследованияявилось изучениеколичественногосодержаниямембраносвязанногогемоглобинаэритроцитовчеловека и егосвязи со структурнымибелками.

литературныйобзор

В силусвоей специализации(перенос кислородаот легких ктканям) эритроцитпо механическимсвойствамявляется уникальнойклеткой, таккак в отличиеот других клетокпостоянноподвергаетсявыраженнымдеформирующимвоздействиямв кровеносномрусле. [9]

Длянормальногофункционированияэритроцитдолжен в течениеотносительнодлительногопериода временисохранять своюцелостностьи быть хорошодеформируемым; последнеесвойство важнопрежде всегодля нормальноймикроциркуляции.В свою очередьдеформируемостьопределяетсярядом факторов, основные изкоторых – формаклетки и эластичностьмембраны. Сейчасможно считатьдоказанным, что эти свойствамембраны эритроцитаи клетки в целомобусловленыналичием белковоймембраннойструктуры, именуемоймембраннымскелетом клеткии расположеннойна внутреннейстороне мембраны.[9] Плазматическуюмембрану эритроцитовследует рассматриватькак открытуюдинамическуюструктуру, способнуюспецифическии неспецифическисвязывать белкиплазмы кровии цитозоляэритроцитов.[6] Исследователипытаются выяснитьмеханизмыметаболическогорегулированиябелковыхвзаимодействийкомпонентовмембранногоскелета междусобой, а такжес интегральнымибелками мембраны, что должноподвести кпониманиюприроды такихпроцессов, какизменение формыи деформируемости, работа транспортныхсистем, изменениеионной проницаемостимембраны. Вданном обзоресделана попыткаобобщить иосмыслитьимеющиесяданные по этому вопросу.

Современныепредставленияо структуреи функции мембранногоскелета эритроцитовчеловека идругих млекопитающихсложились восновном запоследние 25 –30 лет. За этотпериод опубликованряд подробныхобзоров. Наличиесетчатой структуры, выстилающейвнутреннююповерхностьмембраны эритроцита, было обнаруженонепосредственнос помощью электронноймикроскопиипосле обработкиклеток неионнымдетергентомтритоном Х-100.Мембранныйскелет виденв виде двухмернойсети филаментов, длина которыхзависит отособенностейприготовленияпрепарата длямикроскопии.Белковые компонентымембранногоскелета былиидентифицированыс помощьюэлектрофорезав полиакриламидномгеле (ПААГ) вприсутствиидодецилсульфатанатрия (ДДС).

Классическойработой поэлектрофоретическомуразделениюбелков мембраныэритроцитовчеловека являетсяработа Фейрбанксаи соавторов, в которой авторыпредложилиноменклатуруполипептидныхполос, выявляемыхв солюбилизированныхс помощью ДДСмембране; этойноменклатуройпользуютсяв настоящеевремя большинствоисследователей.При одновременномэлектрофорезесолюбилизированныхбелков эритроцитарноймембраны в ПААГв присутствииДДС выявляется20 полос, однакоФейрбанкс ссоавторамивыделили 7 основныхполос, которыебыли пронумерованыот катода каноду. В последующиегоды были внесенылишь незначительныеуточнения вэту номенклатуру.[9]

В связисо способомрасположениямакромолекулв мембранеэритроцитабелки делятна периферические(внутренние)и интегральные.Интегральныеудерживаютсяв мембране. Вих состав входятгликопротеиныи протеолипиды.Функции интегральныхбелков разнообразны: они могут выступатьв роли гидролитическихферментов, рецепторовклеточнойповерхности, окислительно-восстановительныхкомпонентовтранспортнойсистемы электронови в качествеспецифическихбелков входитв состав цитоскелета, который представляетсобой двумернуюсеть, соединеннуюнепосредственнос мембранойэритроцитачерез взаимодействиес интегральнымибелками. Такжек периферическимбелкам относитсяряд эритроцитарныхферментов.

Методфракционированиямембранныхбелков одномернымэлектрофорезомв ПААГ в присутствииДДС позволилиразделить белкимембраны относительноих электрофоретическойподвижности, и полученнымфракциям белковбыли даны номерапо мере уменьшенияих молекулярноймассы.

Полосы1 и 2 Включаютотдельные a-и b-субъединицыспектрина.

Спектрин– основнойбелок цитоскелетаэритроцитов.Спектрин образуетдвумерную сеть, к которой крепятсяактиновыеолигомеры.Молекула спектринапредставляетсобой ab-гетеродимер.По данным электронноймикроскопии, гетеродимерыимеют формуизогнутыхфибрилл длинойоколо 100 нм. Онимогут приниматьразные конфигурации.Каждая цепьмолекулы спектринасодержит более2000 аминокислотныхостатков исостоит излинейно расположенныхструктурныхдоменов. Доменнаяструктура былаустановленас помощью анализапептидныхфрагментовсубъединиц.Вторичнаяструктура a-и b-субъединицсходна и представляетсобой a-спиральныеучастки, разделенныечувствительнымик протеолизуb-структурами.Димеры спектринаассоциируютсяс b-цепьюдругого димера«голова к голове».Никогда невстречаютсяa-a-или b-b-связи.Между димерамии тетрамерамисуществуютобратимыепереходы, которыезависят отусловий среды.При 37 °Сспектринэкстрагируетсяиз мембранэритроцитовв форме димера, при 4 °С– в форме тетрамера.При 30 и 40 °Св растворемежду димерамии тетрамерамиустанавливаетсяравновесие.Так как в обычныхусловиях полученияспектринэкстрагируетсяв форме тетрамера, полагали, чтоin vivo спектриннаходится втой же форме.Электронно-микроскопическийанализ свидетельствуето том, что такиеолигомерыобразуютсяв результатеассоциации3-7 димеров спектрина.Полагают, чтов эритроцитахприсутствуюткак олигомеры, так и тетрамеры, которые образуютдвумерную сетьцитоскелета.Молекула спектринаподвергаетсямножественномуфосфорилированию, степень которогоне влияет наформу эритроцитов.[5]

Полосы2.1, 2.2, 2.3 Представленыразличнымиформами периферическогобелка анкирина.Данные электронноймикроскопиисвидетельствуюто том, что сетьспектринарасположенана определенномрасстоянииот мембраныи, по-видимому, взаимодействует интегральнымибелками мембраны.Латеральнаяподвижностьинтегральныхбелков зависитот присутствияспектрина: этоподтверждаетналичие такоговзаимодействия.При обработкемембран химотрипсиномбыл выделенбелковый фрагментс мол. массой72 kD, которыйингибировалвзаимодействиеспектрина сэритроцитарноймембраной, обедненнойспектрином.Белок был названанкирином, отгреческогоankyra, что значитзаякоривать.Другая группаисследователейназвала егосиндеином, отгреческогоsyndeo, что значитсвязыватьсявместе. Молекулаанкирина (мол.масса 200 kD)имеет сферическуюформу и состоитиз двух доменов: нейтральногои фосфорилированного.Фосфорилированнымдоменом анкиринвзаимодействуетс b-субъединицейспектрина нарасстоянии20 нм от С-концамолекулы. Нейтральныйдомен анкиринаосуществляетсвязь с белкомполосы 3. [5,6]

Белокполосы 3 Белок3 (анионтранспортныйбелок) – одиниз основныхинтегральныхбелков эритроцитарноймембраны –являетсягликопротеидомс мол. массой90 kD. Показано, что этот белокпринимаетучастие в обеспечениианионноготранспорта, в связываниицитоскелетногокаркаса с мембраной, цитоплазматическихбелков гемоглобинаи глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы.Не все молекулыбелка 3 взаимодействуютс анкирином.Если бы всемолекулы белка3 были связаныс анкириноми, следовательно, со всей спектриновойсетью, это исключилобы возможностьлатеральныхперемещенийсамого белка, образованиякластеров итранспортныхфункций. Связьспектрина смембранойосуществляется, вероятно, нетолько черезанкирин, нотакже с помощьюдополнительныхвзаимодействий.Имеющиеся насегодняшнийдень данныесвидетельствуюто том, что белок4.1 обеспечиваетсвязь спектринас интегральнымбелком мембраны.[5] Все перечисленныедополнительныевзаимодействияносят слабыйхарактер и, видимо, играютвторостепеннуюроль по сравнениюсо взаимодействиемспектрин―анкирин―белок3.

Белокполосы 4.1 Необходимдля нормальнойстабилизациимембраны, закрепляетсвязь спектринас актином. Наэлектрофореграммеданный белокразделяетсяна две полосы:4.1а (Mr=80 kD)и 4.1b (Mr=78kD). Переход4.1а в 4.1b осуществляетсяс помощьюдеамидирования.Это глобулярныйбелок с мол.массой 80 kD, составляющийоколо 5% от белковоймассы цитоскелетаэритроцитов.Его изоформысходны поаминокислотномусоставу. Обеизоформы способнывзаимодействоватьсо спектрином.Каждая из нихсодержитсяв количествепримерно 100 000молекул на 1клетку. [5]

Белокполосы 4.2 Паллидин– это олигомер(Mr=72 kD), вклетке присутствуетв димерной итримернойформах с Mr=185kD. Соединяетсяс цитоплазматическимдоменом белкаполосы 3, анкирином, спектриноми белком полосы4.1. [14]

Белокполосы 4.5 В егосостав входятинтегральныебелки – переносчикинуклеозидови глюкозы черезэритроцитарнуюмембрану. Основнаячасть белковполосы 4.5 представленатранспортерамиглюкозы (Mr=55kD). [14]

Белокполосы 4.9 Центральныйкомпонентцитоскелетас Mr=48 kD.Этот белоквыделен в видетримера с Mr=145kD. Стабилизируетвзаимодействияспектрина сактином и влияетна степень егополимеризации.Это фосфопротеин.Белок присутствуетв эритроцитахв количествах, приблизительноравных количествуспектрина. Офункциях этогобелка практическиничего не известно.Возможно, онпринимаетучастие в укреплениицитоскелетногокаркаса (сетицитоскелета).Показано, чтоочищенныйполипептидполосы 4.9 можетвзаимодействоватьс актиновыминитями, снижаяскоростьполимеризацииактина и, возможно, стабилизируякороткие актиновыенити в эритроцитах.[5]

Полоса5 Актин – представленв эритроцитахb-изоформойи по физико-химическимсвойствам схожс актиномпоперечнополосатыхмышц. Так какфункциональнойформой актинаявляется егополимер, изначальнопытались выяснить, есть ли в эритроцитахфиламентныйактин. Электронно-микроскопическиеисследованияпоказали, чтоактин присутствуетв эритроцитахв виде филаментов, содержащихот 12 до 17 мономеровактина. [5] Выделенныемембраны эритроцитов, а также комплексспектрина, актина и белка4.1 способныиндуцироватьполимеризациюмономерногоактина, подобноолигомерамактина. ОбработкацитохалазиномВ подавляетполимеризацию.Так как типичныйфибриллярныйактин не выявляетсяв нативныхэритроцитах, а в опытах invirto можноиндуцироватьобразованиедлинных филаментов, связанных смембраной, следует, по-видимому, предположить, что в эритроцитахсуществуюткакие-то механизмы, ограничивающиерост филаментов, подобно тому, как это делаетцитохалазинВ. Актиновыеолигомерысвязываютсяс N-концоммолекулы спектриналатерально.Каждый тетрамерспектрина имеетдва сайта связываниядля актиновыхолигомеров.Спектрин можетсвязыватьсяс Ф-актином повсей длинеактиновой нити, и эти связи, видимо, существенныдля образованияцитоскелетнойсети. Важнаяроль во взаимодействииактина и спектринапринадлежитбелку полосы4.1, который связываетсясо спектриномв тех же участках, что и актин.Связь спектринас актином вотсутствиебелка 4.1 слабаяи значительноусиливаетсяв его присутствии, поэтому взаимодействиеспектрина иактина называют4.1-зависимым.Комплексы белка4.1, спектринаи актина обладаютгораздо большейустойчивостьюк диссоциациипри седиментациив сахарозе, чемкомплексыактина и спектрина.

Возникаетвопрос о том, какие факторыоказываютвлияние наполимеризациюэритроцитарногоактина. Относительнонизкая концентрацияактина в эритроцитахне может, вероятно, иметь решающеговлияния надлину филаментов.Предположим, что на полимеризациюактина могутвлиять такиеактинсвязывающиебелки, как спектрини белок 4.1. Оказалось, что эти белкиспособны регулироватьскоростьполимеризацииактина, сокращаялаг-фазу, уменьшаяскорость элонгациии не вызываяпри этом никакихизменений впоследовательностиэтапов полимеризации.Спектрин ибелок 4.1 вызываютнуклеациюглобулярногоактина в условиях, когда концентрацияактина нижекритическойи спонтаннаяполимеризацияне происходит.Таким образом, можно предположить, что спектрини белок 4.1 представляютсобой комплексбелков, блокирующихмедленный конецактиновой нитив отличие отбольшинства«запирающих»белков, взаимодействующихс быстрым концом.Однако позжебыли полученыданные, которыепротиворечатэтому предположению.Шен с соавторамивыделили фрагментыцитоскелетаэритроцитовпри обработкерастворамис низкой ионнойсилой при 37 °С.[5] Электронно-микроскопическиеисследованияполученныхфрагментовпоказали, чточасть из нихсодержит филаментыактина, вдолькоторых кластерамирасполагаютсяспектриновыемолекулы. Приинкубации этихпрепаратовс глобулярнымактином (приконцентрацииактина в растворевыше критической)происходилрост актиновыхнитей на обоихконцах. Тсукитас соавторамиизучали полимеризациюактина на мембранахэритроцитов, закрепленныхна электронно-микроскопическихсектах. Приинкубации этихпрепаратовс глобулярнымактином навнутреннейповерхностимембран, содержащихцитоскелетныебелки наблюдалсярост актиновыхфиламентов.[5] При концентрацияхглобулярногоактина, близкихк критическим, рост наблюдалсятолько на медленномконце, а придальнейшемувеличенииконцентрации– на обоих концахнити. При обработкемембран «кэпирующим»белком с мол.массой 45 kD, связывающимсяс быстрым концомактиновыхмикрофиламентов, рост наблюдалсятолько на медленномконце. ДанныеШена и Тсукитыприводят квыводу о том, что в эритроцитахактин существуетв виде филаментовсо свободнымиконцами. Следовательно, спектрин ибелок 4.1 не являютсякэпирующимибелками, однаконесомненновлияют на состояниеактина в эритроцитах, стабилизируяактиновыефиламенты.

Белокполосы 6Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа(ГАФД), молекулярнаямасса составляет35 kD. Располагаетсяна цитоплазматическомдомене анионтранспортногобелка, в составемультиферментногокомплекса.Данный белокявляется ферментомгликолиза ипринимаетучастие в регуляцииокислениягемоглобина.[14]

Полоса7 Основнойсоставляющейполипептид– тропомиозин.Долгое времяоставаласьнеизвестнойприрода белказоны 7. Былопоказано, чтоэтот белоксвязываетсяс антителамик тропомиозину, выделенномуиз мускульногожелудка цыпленка.Молекулярнаямасса белкасовпадала смолекулярноймассой тропомиозинов, выделенныхиз мозговыхтканей, из макрофагови кровяныхпластинок.Тропомиозинэритроцитов– димер с мол.массой 60 kD, состоящий издвух субъединицс мол. массой29 и 27 kD и связывающийсяс мышечнымактином (Ф-актином)при соотношении:1 молекулатропомиозинана 6-7 мономеровактина. Так какв эритроцитахфиламентыактина содержатдо 15-17 мономеров, они могут связыватьдве молекулытропомиозина.[5]

Полоса8 Представленапептиднойчастью ферментаглутатион-S-трансферазы(Mr=23 kD).Взаимосвязьбелка полосы8 с мембранойявляется кальций– зависимой.

В 1985 г.было показано, что еще однимкомпонентомцитоскелетаэритроцитовявляется миозин.С помощьюмоноклональныхантител к тяжелойцепи миозинаФаулер обнаружилв эритроцитахполипептид, который былвыделен иохарактеризован.Белок состоитиз тяжелой цепис мол. массой200 kD и из двухлегких цепейс мол. массами26 и 19,5 kD. В растворахс низкой ионнойсилой он образуетбиполярныефиламенты иобладает АТФазнойактивностью.В эритроцитахмиозин присутствуетпримерно вколичестве6000 молекул на1 клетку, т.е. на1 молекулу миозина, как и в другихклетках, приходитсяоколо 80 мономеровактина. [5]

Белки, образующиецитоскелетэритроцитов, неуникальны.Они или им подобныебелки есть вомногих другихклетках. Преимущественнаяих локализация– вблизи мембран.Вероятно также, что рассмотренныебелки могутбыть полифункциональныи использоватьсяв структурныхкомплексахразного функциональногоназначения.[5]

Полосу9 на электрофореграммесоставляетбелок глобин, который являетсячастью мембрансвязанногогемоглобина.Как уже говорилосьвыше, цитоплазматическийдомен белкаполосы 3, включающийоколо 380 аминокислотныхостатков, локализованв цитоплазмеи играет важнуюроль в поддержанииформы эритроцитаи его метаболизме.N-концеваяпоследовательностьцитоплазматическогодомена богатааминокислотнымиостаткамикислого характера.На этом участкенаходятсяцентры связываниягидролитическихферментов –глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, альдолазы, каталазы, гемоглобинаи гемихрома.Таким образом, цитоплазматическийдомен анионтранспортногобелка и являетсяместом локализациимембрансвязанногогемоглобина, о структуре, свойствах инекоторыхаспектахфункционированиякоторого будетсказано ниже.

ГемоглобинГемоглобин– белок эритроцитов, красных кровяныхклеток, переносящиймолекулярныйкислород отлегких к тканямв организмахпозвоночныхживотных. Гемоглобинможно считатьсвоего родамодельнымбелком, структура, свойства ифункции которогонаиболее полноизучены посравнению сдругими белкамина протяжениипоследних 50лет. Американскийфизик Хопфилдназвал егоатомом водородасовременнойбиохимии, имеяв виду, что изучениегемоглобинасыграло в биохимииту же роль, чтои изучениеатома водородав физике. Гемоглобинназывают такжепочетным ферментом, посколькуисследованияего структурыв статике идинамике позволилизначительнопродвинутьсяв пониманиимеханизмовфункционированияферментов.Структура этогоглобулярногобелка известнав деталях главнымобразом благодаряработам английскогобиофизика МаксаПерутца, которыйполучил первыерентгеноструктурныеданные еще вконце 40-х годовнашего века.За эти исследованияон был удостоенНобелевскойпремии.

СтруктурагемоглобинаМолекула гемоглобинасостоит изчетырех субъединиц: двух aи двух b- и соответственносодержит четыреполипептидныецепочки двухсортов. Каждаяa-цепочкасодержит 141, аb-цепочка– 146 аминокислотныхостатков. Такимобразом, всямолекула гемоглобинавключает 574аминокислоты.Хотя аминокислотныепоследовательностиa- иb-цепочекразличны, ониимеют практическиодинаковыетретичныепространственныеструктуры.Собственноговоря, приведенныевыше деталиструктурыотносятся нек гемоглобину, а к его белковойкомпоненте– глобину. Каждаясубъединицагемоглобинасодержит однунебелковую(так назваемуюпростетическую)группу – гем.Гем представляетсобой комплексFe(II) спротопорфирином.Структура гемапредставленана рис.1, а. [2]

Атомжелеза можетобразоватьшесть координационныхсвязей. Четыресвязи направленык атомам азотапиррольныхколец, оставшиесядве связи –

/>

Рис.1. Структурагема (а), структураактивногоцентра дезоксигемоглобина(б), структураактивногоцентра оксигемоглобина(в).

перпендикулярнок плоскостипорфириновогокольца по обеего стороны.Гемы расположенывблизи поверхностибелковой глобулыв специальныхкарманах, образованныхскладкамиполипептидныхцепочек глобина.Гемоглобинпри нормальномфункционированииможет находитьсяв одной из трехформ: феррогемоглобин(обычно называемыйдезоксигемоглобиномили простогемоглобином), оксигемоглобини ферригемоглобин(называемыйтакже метгемоглобином).В феррогемоглобинежелезо находитсяв закиснойформе Fe(II), одна из двухсвязей, перпендикулярныхк плоскостипорфириновогокольца, направленак атому азотагистидиновогоостатка, а втораясвязь свободна(рис.1, б). Кромеэтого гистидиновогоостатка, называемогопроксимальным(соседним), подругую сторонупорфириновогокольца и набольшем расстоянииот него находитсядругой гистидиновыйостаток — дистальныйгистидин, несвязанныйнепосредственнос атомом железа.Взаимодействиемолекулярногокислорода сосвободным гемомприводит кнеобратимомуокислению атомажелеза гема[Fe(II) ЮFе(III); гем Югемин]. В дезоксигемоглобинеглобин предохраняетжелезо гемаот окисления.

РеакцияоксигенацииОбратимоеприсоединениекислорода(оксигенация), позволяющеегемоглобинувыполнять своюосновную функциюпереносчика, обеспечиваетсявозможностьюобразоватьпрочные пятуюи шестую координационныесвязи и перенестиэлектрон накислород неот железа (тоесть окислитьFe2+), а отимидазольногокольца проксимальногогистидина. Этосхематическиизображенона рис.1, б. Вместомолекулярногокислородажелезо гемаможет присоединитьокись углеродаСО (угарныйгаз). Даже небольшиеконцентрацииСО приводятк нарушениюкислородпереносящейфункции гемоглобинаи отравлениюугарным газом.

Вышебыло сказано, что одна молекулагемоглобинасодержит четыресубъединицыи, следовательночетыре гема, каждый из которыхможет обратимоприсоединитьодну молекулукислорода.Поэтому реакциюоксигенацииможно разделитьна четыре стадии:

Hb+O2ЫHbO2 (1a)

НbO2+O2ЫHb(O2)2 (1б)

Hb(O2)2+O2ЫHb(O2)3 (1в)

Hb(O2)3+O2ЫHb(O2)4 (1г)

Преждечем рассмотретьэту главнуюфункциональнуюреакцию гемоглобинаболее детально, необходимосказать несколькослов о мышечномгемоглобине— миоглобине.Этот красящийбелок поперечнополосатыхмышц представляетсобой комплексгема с «четвертушкой»глобина. Онсодержит однумолекулу гемаи одну полипептиднуюцепочку, состави структуракоторой подобнысоставу и структуреb-субъединицыгемоглобина.Как и для гемоглобина, важнейшейфункцией миоглобинаявляется обратимоеприсоединениемолекулярногокислорода. Этуфункцию характеризуеттак называемаякривая оксигенации, связывающаястепень насыщениягемоглобинакислородом(в процентах)с парциальнымдавлениемпоследнего, рО2 (мм Hg).Типичные кривыеоксигенациигемоглобинаи миоглобина(при условиидостиженияхимическогоравновесия)приведены нарис.2, а, б. Длямиоглобинакривая являетсягиперболой, как и должнобыть в случаеодностадийнойхимическойреакции приусловии достиженияхимическогоравновесия:

Mb+O2ЫMbO2 (2)

где Mb- миоглобин.

/>

Рис. 2Кривые оксигенации

миоглобина(а) и гемоглобина(б)

Совершеннодругая картинавозникает вслучае гемоглобина.Кривая диссоциацииимеет S-образнуюформу. Без кислородамолекулы гемоглобинаобладают низкимсродством ккислороду иравновесиереакции (1а) сдвинуто влево. Затемкривая становитсякруче и привысоких значенияхрО2 практическисливается скривой диссоциациимиоглобина.[2]

/>

Рис. 3. Логарифмическиеанаморфозыкривых оксигенациимиоглобина(a) и гемоглобина(б)

М.Перутцпишет, чтораспределениемолекул кислородапо молекуламгемоглобинаследует библейскойпритче: «Каждому, у кого есть, дай еще, и унего будетизбыток; у тогоже, у кого нет, забери то немногое, что у него осталось».Это заставляетпредположить, что между гемамиодной молекулыгемоглобинасуществуетнекотораясвязь, благодарякоторой присоединениекислорода кодному гемувлияет наприсоединениекислорода кдругому гемутой же молекулы.Это явлениебыло известнозадолго доработ Перутцаи установленияструктурыгемоглобинаи механизмаего реакциис кислородом.Оно получилоназвание гем-гемвзаимодействия.Физиологическийсмысл гем-гемвзаимодействияочевиден. Сигмоиднаяформа кривойдиссоциациисоздает условиямаксимальнойотдачи кислородапри переносегемоглобинаот легких свысоким значениемpO2 к тканямс низким значениемpO2. Длячеловека значенияpO2 артериальнойи венознойкрови в нормальныхусловиях (Т37°С,pH 7,4) равнысоответственно100 и 40 ммHg. Приэтом (рис.2, б)гемоглобинотдает тканям23% связанногокислорода(степень оксигенациименяется от98 до 75%). При отсутствиигем-гем взаимодействиядля одногемовогомиоглобина(рис.2, а) этавеличина непревышает 5%.Миоглобинпоэтому служитне переносчиком, а депо кислородаи отдает егомышечной тканилишь при резкойгипоксии, когданасыщение тканикислородомпадает до недопустимонизкого значения.[2]

Логарифмическаяанаморфозакривой диссоциациигемоглобиначеловека представленана рис.3, б. В этомслучае началокривой представляетсобой прямуюпод углом 45°к координатнымосям, как и длямиоглобина: первые молекулыкислородасоединяютсяв основном смолекуламигемоглобина, еще не содержащимикислорода, игемы такимобразом оксигенируютсянезависимо.Это свидетельствуюто том, что гем-гемвзаимодействиеобусловленоне просто наличиемнесколькихгемов в молекуле, а тем, что послеоксигенацииодного гемаменяются условияоксигенациидругих гемовтой же молекулы.Затем наклонкривой увеличивается.Тангенс угламаксимальногонаклона получилназвание коэффициентаХилла (n), который отражаетстепень кооперативностипроцесса. Длямиоглобинаn=1, а длягемоглобиначеловека (внорме) n~3.Вблизи областиполного насыщениягемоглобинакислородомнаклон кривойснова становитсяравным 45°(большинствомолекул гемоглобиналибо не содержатсвободныхгемов, либоимеют лишь одингем, способныйприсоединитькислород).

МеханизмкооперативностиВ 1963 году Моно, Шанже и Джекобобнаружили, что активностьнекоторыхферментовменяется скачкоммежду двумязначениямипри воздействиина белок некоторыхнизкомолекулярныхагентов, непринимающихучастия непосредственнов каталитическомакте. Такие ферменты получилиназваниеаллостерических, а само явление– аллостерии.Предполагается, что эти ферментымогут находитьсяв разных состояниях, переключениемежду которымиосуществляетсяпри присоединенииспецифическогонизкомолекулярноголиганда (необязательновблизи активногоцентра). В 1965 годуМоно, Уаймани Шанже поняли, что гемоглобин, не являясьферментом, принадлежитк тому же классубелков. К томувремени ужебыло известно, что структурыглобул оксигемоглобинаи гемоглобинаразличны, иавторы предположили, что состоянияс разными значениямиконстант оксигенациисоответствуютразличнымпространственнымструктурамбелка. Длягемоглобинапостулируетсяналичие двухтаких состояний:R (от англ.relaxed) и Т (отангл. tense).Состояние Rхарактеризуетсявысоким, а Т –низким сродствомк О2 (сильнееи слабее связываютмолекулярныйкислородсоответственно).В рамках этойконцепциисчитается, чтокак в R-, таки в Т-состояниисродство ккислородусубъединицодной глобулы(т.е. есть всехчетырех гемоводной глобулы)одинаково. Этотпостулат позволяетпостроитьсравнительнопростую математическуюмодель кооперативныхсвойств гемоглобина: КR, КТи L (константыравновесияреакций ассоциациив состоянияхR, Т и отношениечисла молекулгемоглобинав состоянияхТ и R соответственно).На рис.2, б ясно, что КТR.Очевидно, увеличениеконстантыассоциациипри переходеиз состоянияТ в состояниеR соответствуетв расчете наодин гем изменениюсвободнойэнергии системы

DG= 2,3 RT lg(KR/KT)кДж/моль. (7)

Для гемоглобина человека при 37°С эта «свободная энергия кооперативности»равна 5,61 кДж/моль.В физиологическихусловиях приотсутствиикислорода лишь~ 3·10-5% молекул гемоглобинанаходятся вR-форме, ав условияхполного насыщениякислородомлишь ~ 7-10-3% — в Т-форме. [2]

Измененияэлектроннойи пространственнойструктурыгемоглобинав процессеоксигенацииНа рис.4 схематическипоказаны электроннаяструктуражелеза гема, положение атомажелеза относительноплоскостипорфириновогокольца гема, спектральныеи магнитныехарактеристикимолекул в различныхсостоянияхмолекулы гемоглобина: дезоксигемоглобин, оксигемоглобини ферригемоглобин.Следует подчеркнуть, что во всехслучаях речьидет о равновесныхсостоянияхмолекул белка.Мы увидим далее, что переходиз одного состоянияв другое требуетзначительного(в молекулярныхмасштабах)времени, в течениекоторого системапроходит черезнескольконеравновесныхсостояний, заметно отличающихсяпо своим физическими химическимсвойствам отравновесных.[2]

В молекуледезоксигемоглобинажелезо отстоитот плоскостипорфириновогокольца примернона 0,5-0,6 А° (естьнебольшиеотличия междуa- иb-субъединицами).Из шести 3dэлектроновжелеза Fe(II)два электронаспарены наодной из низшихd-орбиталей(dxy,dyz,dxs),а четыре электроназанимают оставшиесяd-орбитали, ихспиновые моменты, согласно правилуХунда, параллельныи суммарныйспин S-2.Магнитныймомент гемав этом состоянииравен ~ 5,5 боровскогомагнетона (БМ), а спектр поглощенияв зеленой областиимеет характернуюполосу с lmax~ 556 нм. Присоединениекислорода ведетк значительнымизменениям.Атом железав оксигемоглобинележит практическив плоскостипорфириновогокольца (расстояниедо плоскостисоставляет0,16 А° в α-и 0,00 А° в β-субъединицах).Все шестьd-электроновспарены на трехнизших d-орбиталях,S= 0, оксигемоглобиндиамагнитен.В зеленой областиспектра имеютсядве характерныеполосы поглощения:а (lmax576 А°) и b (542А°).

/>

Рис.4. Основныехарактеристикимолекулы гемоглобинав различныхсостояниях.

Вферригемоглобине(метгемоглобин)при нейтральныхзначениях рНместо кислородазанимает молекулаводы (при щелочныхзначенияхрН-ОН), железо находитсязначительноближе к плоскостигема, чем вдезоксигемоглобине, все пять d-электроновнеспарены изанимают пятьd-орбиталей.S= 5/2 и магнитныймомент равен5,91 БМ.

Структурныеизменения вактивном центре(вблизи гема)приводят и кзначительнымизменениямпространственнойструктуры всегобелка. Приоксигенации(переход от Т-к R-форме)смещение отдельныхаминокислотныхостатков достигает7 А°.Как уже былосказано выше, четвертичнаяструктурагемоглобинахарактеризуетсяналичием четырехполипептидныхцепей, образующихдве (a-и две b-субъединицы).Более детальныеисследованияпоказали, чтосубъединицыобразуют ab-димеры.ТЮR– переходсопровождаетсяповоротомодного димераотносительнодругого на12-15° ив конечномсчете приводитк увеличениюкарманов, вкоторых находятсягемы. Эти структурныеизмененияинициируютсяприсоединениемпервой молекулыО2 к одномуиз свободныхгемов и распространяютсяна всю глобулу.Именно поэтомув равновеснойсмеси всегдаприсутствуюттолько Т- и R-формы.Эти димеры вТ-форме стягиваются14 дополнительными(по сравнениюс R-формой)солевыми мостиками(водородныесвязи междуионными илинейтральнымигруппами аминоксилот, ван-дер-ваальсовыконтакты). Крометого, междуb-субъединицамив Т-форме присоединяетсямолекуладифосфоглицерата, что также приводитк сужению карманов.Эти изменениясхематическипредставленына рис.5.

Триггеромдля всех описанныхвыше структурныхперестроекпри переходахмежду Т- и R-формамии обратно служитприсоединениеили отщеплениекислорода.После локальногоэлементарногохимическогоакта: присоединениеили отщеплениенизкомолекулярноголиганда, окислениежелеза приобразованииферригемоглобина(иначе говоря, после появлениилишнего положительногозаряда на железе)– возникаетсущественнонеравновесноеконформационноесостояние –изменениявблизи активногоцентра ужепроизошли, ався огромнаямолекула белкаосталась впрежнем, ещене отрелаксировавшемсостоянии.Последующаярелаксацияможет заниматьмикросекундыи даже секунды.В ходе этойрелаксациименяются нетолько физические, но и химическиесвойства белка, в частностискорости последующиххимическихактов, если ониуспевают произойтидо полногозавершениярелаксации.Таким образом, описанная вышекартина процессов, сопровождающихобратимоесвязываниекислородагемоглобином, является лишьпервым, хотяи очень важнымприближениемк истине. Так, например, быстроевосстановлениежелеза в ферригемоглобинекоротким (микро-или наносекунды)импульсомэлектроновприводит квозникновениюнеравновесногосостояния, вкотором железоуже восстановлено, но не отошлоот плоскостипорфириновогокольца. Поспектральными магнитнымхарактеристикамэто состояниесоответствуетравновесномуоксигемоглобину.Релаксациягема и его ближайшегоокружения судалениемжелеза от плоскостипорфириновогокольца занимаетпри комнатнойтемпературедесятки микросекунд, а полная релаксациявсей белковойглобулы к равновеснойТ-форме дезоксигемоглобина— сотни миллисекунд.

/>

Рис.5. Структурнаясхема переходагемоглобинаот Т- к R-форме

Другиереакции и функциигемоглобинаПри взаимодействиимолекулярногокислорода сгемоглобиномсуществуетнебольшая, ноконечная вероятностьокисленияпоследнего: молекула О2не присоединится, но окислитжелезо: Fe2++ O2 ЮFe3+ O2-.Поэтому придыхании в эритроцитахнепрерывнообразуетсяметгемоглобин.Для его восстановленияв эритроцитесуществуетспециальнаяферментативнаясистема, восстанавливающаяметгемоглобини превращающаяего в нормальныйдезоксигемоглобин.При нарушенииэтой системывозникаеттяжелое заболевание— метгемоглобинемия, при которомгемоглобинперестает бытьпереносчикомкислорода.

Гены, ответственныеза синтезгемоглобина, могут подвергатьсямутациям, меняющимструктуру ифункции белка.Наиболее изученамутация, приводящаяк замене толькоодной аминокислотыв полпептидныхцепочках b-субъединицгемоглобина.Замена глутаминана валин ведетк тяжелой болезни– серповидноклеточнойанемии: эритроцитыпринимают формусерпа и теряютспособностьпереноситькислород.

Присоединениекислородаменяет кислотно-основныесвойства гемоглобина.Оксигемоглобинявляется болеесильной кислотой, чем дезоксигемоглобин.Поэтому в тканях, где значительнаячасть гемоглобинатеряет кислороди становитсяболее сильнымоснованием, гемоглобинсвязываетобразующуюсяв ходе метаболическихвнутриклеточныхпроцессовуглекислоту.В альвеолахлегких дезоксигемоглобинснова превращаетсяв оксигемоглобин, становитсяболее сильнойкислотой испособствуетотщеплениюСО2. Это слегкаупрощенноеописание важногопроцесса транспортауглекислотыэритроцитами.Углекислота, освобождаемаятканями, недостаточнохорошо растворимадля эффективногопереноса. Спомощью ферментакарбоангидразы, ускоряющегопрямую и обратнуюреакцию

СО2+Н2ОЫНСО3-+Н+ (8)

двуокисьуглерода превращаетсяв хорошо растворимыйбикарбонат-анион.В капиллярахтканей отщеплениекислородаповышает содержаниедезоксигемоглобина, связывающегопротоны и смещающего, таким образом, равновесиереакции (8) вправо.Легко растворимыйион бикарбонатапереноситсякровью. В альвеолахлегких гемоглобиноксигенируется, протоны освобождаютсяи равновесие(8) смещаетсявлево. Образуетсяплохо растворимаядвуокись углеродаСО2, котораяудаляется изводной фазыи выдыхается.Таким образом, гемоглобинработает какбуфер с переменнымзначением pK.Функция гемоглобинакак переносчикауглекислотыне менее важна, чем его функцияпереносчикакислорода.

Гемоглобин– одно из наиболеехорошо изученныхбелков. Десяткилет исследованийгемоглобинав описании ипониманиифизических, химическихи биологическихаспектов егофункционирования.Огромный вкладвнесли работыМакса Перутцаи его сотрудниковв Кавендишскойлаборатории(Кембридж, Великобритания).Однако важностьэтих работкасается нетолько гемоглобина.Они послужилиосновой развитиясовременныхпредставленийо механизмахферментативногокатализа, связавнепосредственнокинетику итермодинамикубиохимическихреакций с динамикойконформационныхизменениймакромолекулбелка. Еслиотвлечься отнепосредственнойпрактическойпользы полученныхрезультатовдля медицины, фармакологии, то фундаментальноезначение работпо изучениюмеханизмафункционированиягемоглобиназаключаетсяв стимулированиипрогресса вустановлениизаконов протеканияважнейшихпроцессов: ферментативногокатализа ивнутриклеточнойтрансформацииэнергии вбиологическихсистемах. [2]

Об участиигемоглобинав мембраннойорганизацииэритроцитовсвидетельствуетфеномен образованиясерповиднойи других формэритроцитовпри различныхгемоглобинопатиях, первоосновукоторого исоставляетаномальноевзаимодействиеэритроцитарноймембраны смутантнымигемоглобинами.Не исключено, что изменениеупруго-механическихсвойств эритроцитарныхмемран приповышенииотрицательногозаряда их внешнейповерхностипроисходитвследствиеулучшенияусловий длясоздания иструктурированиябелкового слоя, формируемогос участиемгемоглобинана внутреннейповерхностиэритроцитарныхмембран. [13]

Показано, что при получениибезгемоглобиновыхтеней эритроцитовв препаратахэлектронно-микроскопическиобнаруживаетсябольшое количествовезикул диаметромпримерно 100 нм, что свидетельствуето частичнойфрагментацииплазматическоймембраны эритроцитов.В то же времяесли в мембранахсодержитсямного гемоглобинаи других белков, обнаруживаемыхв примембранныхслоях, то фрагментациимембраны определяемойтаким образом, не наблюдается.Имеются и другиедоказательствастабилизирующегодействия гемоглобинана эритроцитарныемембраны. Например,S.Knutton исоавторамудалось получитьдве фракцииэритроцитарныхмембран, различающихсясодержаниемсвязанногос ними гемоглобина.Ими было показано, что во фракцииэритроцитарныхмембран с большимсодержаниемгемоглобинаразрушениелипопротеиновойструктурымембран приих дегидротациипроисходитнамного слабее, чем в случаес фракциейэритроцитарныхмембран с малымсодержаниемгемоглобина.В основе измененияусловий дляструктурированиябелково-образующегопримембранногослоя внутриэритроцитовможет лежатьизменениеэлектрическихповерхностныхсвойств навнешней стороне.Это возможновследствиетого, что длямембран в липиднойзоне дебаевскийрадиус экранировкизарядов гораздобольше ее толщины, в результатеповерхностныезаряды с обеихсторон эритроцитарныхмембран взаимновлияют другна друга, образуясамосогласованнуюсистему. Крометого, условиядля образованиябелкового слоя, стабилизирующегомембраны эритроцитов, могут изменятьсяи в результатезащелачиванияих внутреннейсреды, что имеетместо присуспендированииэритроцитовв щелочной илинеэлектролитнойсреде, например, сахарозной.Это можетспособствоватьгемоглобинуи другим примембраннымбелкам за счетизменения ихсвойств образовыватьпрочный примембранныйбелковый слой(в отношениигемоглобина, например, известно, что его свойства, в том числекислородосвязывающие, сильно изменяютсяпри варьированиирН). Вместе стем защелачиваниевнутреннейсреды эритроцитовне всегда можетслужить фактором, стабилизирующимих структуру.В литературе, например, утверждают, что для эритроцитовноворожденноготеленка, длякоторых характерноналичие фетальногогемоглобина, любые экспериментальныеманипуляции, результатомкоторых являетсявнутриклеточноезащелачиваниесреды, вызываютих самопроизвольныйгемолиз. Помере развитияорганизмателенка (2-3 месяцажизни) эритроцитыс нормальнымгемоглобином, появляющиесявзамен вытесняемыхиз кровеносногорусла клеток, содержащихфетальныйгемоглобин, становятсяустойчивымик внутриклеточномузащелачиваниюих среды. Приэтом важноотметить, что, по данным литературы, в гемолизефетальныхэритроцитовпри защелачиванииих внутреннейсреды, помимофетальногогемоглобина, определеннаяроль принадлежити мембранномубелку bandIII. [13]

Приведенныелитературныеданные даютоснованиесделать выводо тесной взаимосвязипроцессовметаболизма, трансмембранноготранспорта, изменений формыи механическихсвойств эритроцита, что, по-видимому, позволяеторганизмуосуществлятькоординированнуюрегуляциюфункционированияклетки черезсоответствующиерецепторныеструктуры, имеющиеся нанаружной поверхностимембраны. [9]

Такимобразом, вподдержанииструктурнойцелостностиэритроцитовважное значениеимеют внутренниепримембранныебелковые слои, структура ивзаимодействиекоторых сэритроцитарнымимембранамивзаимно обусловленыи в целом представляютсобой единуюструктурнуюорганизацию.Поэтому всякаямодификациякак самой мембраны, так и содержащегосяв них гемоглобинав конечномсчете сопровождаетсяи модификациейэтой особойорганизации, частным примеромпроявлениякоторой можетбыть изменениеее механическихсвойств. [13] Приведенныеданные побудилинас провестиисследованиес целью оценкиколичественногосодержаниямембрансвязанногогемоглобинаэритроцитовчеловека и егосвязи со структурнымибелками.

материал иметоды исследования

Материалисследования

Материаломнастоящегоисследованияпослужилиэритроциты124 практическиздоровых лиц, проживающихв городе Курске, в возрасте от18 до 47 лет. Набордобровольцевпроводилсяпри исключениилюбой соматопатологии.

У обследуемыхпроводилсязабор кровииз локтевойвены в сухуюстерильнуюпосуду в количестве5-7 мл с цельюполученияобразов эритроцитарныхмембран.

Методы исследования

Длядостиженияпоставленнойцели и решениязадач настоящейработы использовалсякомплекс методов.

Биохимическиеметоды.

Реактивыи биоматериалы.В работе использовались: декстран Т-500фирмы «SIGMA»(США), HBS –целлюлоза фирмы«SIGMA» (США), гидрофосфатнатрия, хлористыйнатрий, мочевинафирмы «Bio-Rad»(США), трис, 2 –меркаптоэтанол, персульфатаммония «Reanal»(Венгрия), додецилсульфатнатрия (ДДС)фирмы «Диа-Фарм»(Россия), акриламид«SIGMA» (США),N,Nў- метилен бисакриламид«FLUKA» (Швейцария), кумасси G– 250 фирмы «Serva»(ФРГ), бромфеноловыйсиний, ТЕМЕД, глицин, наборбелков дляопределениямолекулярноговеса MS-2 (Россия).

Реактивыотечественногопроизводствабыли марки «ХЧ»и «ОСЧ».

Получениеэритроцитов.Эритроцитыполучали из5 мл гепаринизированнойкрови по методуБейтлера снезначительноймодификацией.[14] Сначалагепаринизированнуюкровь отстаивалидважды в раствореPBS, содержащем3% декстран Т–500, в течение30 минут. Затемэритроцитарнуюмассу подвергалидополнительнойочистке, пропускаяее через колонкус HBS-целлюлозой, после чегоэритроцитыценрифугировалипри 3000 оборотахв минуту. Далееиз полученнойочищенной массыэритроцитовпроводиливыделениемембран.

Выделениемембран. Дляполученияпрепаратовмембран эритроцитыразрушалиосмотическимшоком по методуDodge с небольшоймодификацией, заключавшейсяв том, что гемолизэритроцитови отмывку «теней»проводилидвукратно в10 мМ Na – фосфатномбуфере с добавлениемингибиторапротеназ PMSF.После этогомембраны эритроцитовлиофилизировалии хранили при-20°С.

Одномерныйэлектрофорезпо Лэммли.Электрофорезв присутствииДДС проводилимодифицированнымметодом методомЛэммли. [14] Дляэтой целииспользовалиследующиерастворы:

60% акриламид –0,8% метилен бисакриламид.

Буфер для разделяющего геля: 1 М трис – HCI (pH 8,8).

Буфер для концентрирующего геля: 0,5 М трис – HCI (pH 6,8).

10% додецилсульфат натрия.

10% персульфат аммония.

ТЕМЕД.

Электродный буфер для ЭФ: 0,025М трис, 0,193М глицин, 0,1% додецилсульфат натрия.

Растворыхранились при+4°Сдве-три недели.Раствор 5 готовилсяперед использованием.

Электрофорезпроводили впластинах ПААГразмером 180х180х1мм, приготовленныхс линейнымградиентомконцентрацииакриламида5 — 25%.

Для приготовленияодной пластиныПААГ брали:0,85 мл раствора1, 5,5 мл дистиллированнойводы, 3,6 мл раствора2, 101 мкл раствора4, 5 мкл раствора6 и 20 мкл раствора5 (легкий раствор,5%). В тяжелом (25%)растворе вотличие отлегкого бралось4,2 мл раствора1 и 2,6 мл дистиллированнойводы. Черезсмеситель этирастворы подавалисьперистальтическимнасосом вформировательпластины, втечение 10 минутзаполняя пластинуна 4 см ниже верхнегокрая. Сверхуна полимеризующуюсясмесь наслаивалось0,5 мл дистиллированной воды. Так формировался разделяющий гель. Полимеризацияпродолжаласьв течение 30-40минут. Послеполимеризацииводу удалялии заливалираствор, формирующийконцентрирующийгель. Для приготовлениятакого растворабрали 660 мклраствора 1, 100 мклраствора 4, 2,5 млраствора 3, 4 мклраствора 6, 70 мклраствора 5 и 6мл дистиллированнойводы. Вставлялиформировательлунок и наслаивали0,3 мл дистиллированнойводы. Полимеризацияпродолжаласьв течение 20 минут, после чегопластины ПААГмогли хранитьсяпри =4°С в течениедвух суток.

Подготовкапроб Для приготовленияанализируемогообразца дляЭФ брали 1 мглиофилизированныхмембран эритроцитови растворялив 40 мкл уравновешивающегобуфера, в составкоторого входили:

(на10 мл уравновешивающегобуфера)

3 г мочевины;

0,2 г ДДС;

1,25 мл раствора 3;

0,5 мл меркаптоэтанола;

5 мкл красителя бромфенолового синего.

Уравновешивающийбуфер хранилипри температуре-20°С в течениемесяца.

Подготовленныетаким образоманализируемыеобразцы стоялив течение одногочаса при комнатнойтемпературе, после чего ихвносили объемом15 мкл в сформированныев концентрирующемгеле лунки.

Электрофорезпроводили присиле тока 35 мА, пока напряжениене возрасталодо 300 В, затемстабилизировалиисточник питанияпо данномунапряжениюи проводилиЭФ этом режиме, пока лидирующийкраситель недоходил 1 см докрая пластины.

ПослеЭФ фореграммыокрашивалив течение одногочаса красителемКумасси G- 255 по модифицированнойметодике Fairbanksв растворе, содержащем10% уксусной кислоты,25% изопропанола,0,05% кумасси голубого.После этогонесвязавшуюсякраску отмывалив течение 12 часов10%-ной уксуснойкислотой дополного исчезновенияфонового окрашивания.

Отмытыефореграммызатем дегидратировалив течение 30 минутв растворе, содержащем280 мл изопропанола,25 мл глицеринаи 195 мл дистиллированнойводы. Далеепластины ПААГплотно фиксировалимежду двумяслоями целлюлознойбумаги и в натянутомвиде высушивалипри комнатнойтемпературе.

Наэлектрофореграммахидентифицировали17 белковых фракций.

Денситометрирование. Денситометрирование электрофореграммпроводили налазерном денситометре«Ultrascan XL».Молекулярнуюмассу белковопределялис помощью маркерныхбелков с известноймолекулярноймассой: бычийсывороточныйальбумин (Mr=68kD), овальбумин(Mr=43 kD), химотрипсиноген(Мr=25 kD), миоглобин(Мr=17,5 kD) и цитохром(Мr=12,4 kD).

Определениеконцентрациибелка. Содержаниебелковых фракцийв исследуемомобразце определялипо известноймассе маркерногобелка бычьего сывороточного альбумина, через полученные при деситометрированииплощади альбуминаи каждой белковойфракции в отдельностипо формуле:

m(x)=S(x)ґ4.5/S(a),

где m(x)– масса белковойфракции,

S(x)– площадь этойфракции подпиком на денситограмме

4.5– масса маркерногобелка альбуминав мкг,

S(a)– площадь маркерногобелка альбуминапод пиком наденситограмме.

Дальнейшийпересчетколичественногосодержаниябелковых фракцийпроводили на1 миллиграммобщего белка.

Методы статистическойобработки

Статистическаяобработкаматериалапроведена наПВМ IBM PC/AT(486) с использованиемпрограммы «Gen1», составленнойд.б.н ТрубниковымВ.И. и пакетаприкладныхпрограмм«STATGRAPHICS v3.0».

Приописанииколичественныхпризнаковиспользовалисьпараметрынормальногораспределения: среднее значение, стандартнаяошибка среднегозначения, несмещеннаядисперсия. Дляпроверкистатистическихгипотез использовалисьпараметрическиекритерии Стьюдентаи Фишера. Уровеньзначимостипринималиравный 0,05.

Кластерныйанализ. Припроведениикластерногоанализа в качествеобъектов выступалииндивиды иизучаемыепризнаки, амерой сходстваслужили коэффициентыкорреляциибез учета знака.Результатыкластерногоанализа позволилиопределитьсоответственнонекоррелированныегруппы изучаемыхпараметров, детерминирующихфенотипическуюизменчивостьпризнаков. Накаждом шагекластеризациивыбиралсянаибольшийпо значениюэлемент матрицы, стоящий напересеченииi-й строкии j-го столбцаобъединенияi-го и j-гопризнаков вкластер, рассматриваемыйкак новый признак.Для выделениякластерапересчитывалисьзначениякоэффициентовкорреляциив матрице стем, чтобы наследующем шагекластеризациипоиск максимальногокоэффициентакорреляциипроводилсяс учетом предыдущихрезультатов.Приведенныйалгоритм кластерногоанализа служиллишь для подразделениякорреляционнойматрицы наотдельныеподсистемыбез проверкистатистическойзначимостиуровней объединениякластеров.Проверка гипотезыо некоррелированностивыделенныхподсистемосуществляласьс использованиемспециальныхкритериев.

РЕЗУЛЬТАТЫСОБСТВЕННЫХИССЛЕДОВАНИЙ

Количественноесодержаниегемоглобинаи основныхбелков мембранэритроцитовчеловека.

В ходеданной работынами было проведеноизучениеколичественногосодержанияосновных белковэритроцитарныхмембран имембрансвязанногогемоглобина.Полученныерезультатыпредставленыв таблице 1.

В зависимостиот электрофоретическойподвижностибелки былиразделены на15 фракций, 16-юсоставил гемоглобин.При электрофорезебелковые фракциирасположилисьпо мере уменьшениямолекулярныхмасс белков.Из таблицы 1видно, что наиболеепредставительнымибелками в мембранахэритроцитовчеловека являютсяанионтранспортныйбелок полосы3, a- иb-спектриныи актин. Второеместо по количественномусодержаниюзаняли белкиполосы 4.5 (транспортерглюкозы инуклеозидов), белки полосы7 (основным белкомэтой полосыявляется тропомиозин)и белок полосы4.2 (паллидин).

Менеепредставительнымиоказалисьанкирины 2.1, 2.2, и2.3, белок полосы4.1, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназаи глутатион-S-трансфераза.Наименьшимсодержаниемотличался белокполосы 4.9 имембрансвязанныйгемоглобин.Количественноесодержаниегемоглобинасоставило17,40±0,74 мкг на 1 мгобщего белкамембран. Крометого, гемоглобинусоответствовалои наименьшеезначение дисперсии(d2=66,91).

Проведенноеисследованиеколичественногосодержанияосновных белковмембран эритроцитовпозволилооценить ихпредставительность.Полученныенами показателисогласуютсяс литературнымиданными. [4, 5]

Взаимноеварьированиеколичественнойпредставительностиотдельныхбелков эритроцитовчеловека.

С цельюустановленияособенностейвзаимноговарьированиясодержаниябелковых фракцийв анализируемыхобразцах намибыл проведенмногомерныйколичественногосодержаниябелков эритроцитарныхмембран человека.Была построенаматрица фенотипическихкорреляцийколичественногосодержаниягемоглобинаи основныхбелков мембранэритроцитов.Данная матрицапредставленав таблице 2. Изнее видно, чтополученныекоэффициентыкорреляцииимели какположительную, так и отрицательнуюнаправленность.

Дляустановленияприоритетностиво взаимосвязяхвариабельностиколичественногосодержаниягемоглобинаи основныхмембранныхбелков эритроцитовнами был проведенкластерныйанализ. Полученныерезультатыпредставленына рисунке 6.

Кластерныйанализ корреляционнойматрицы позволилвыделить 4 группывзаимнокоррелирующихбелков по ихколичественномусодержанию.Первую группусоставили a-и b-спектрины, белки полосы4.1, 4.2 (r=0,255). В составвторой группывошли анкирины2.1, 2.2 и 2.3 (r=0,278). Третьюгруппу образовалигемоглобин, тропомиозин, глютатион-S-трансферазаи белок полосы4.5.1 (r=0,316). Четвертуюгруппу составилиактин, белкиполосы 4.5, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназаи анионтранспортныйбелок полосы3 (r=0,209). Исключение составила фракция 4.9, вариабельностьколичественногосодержаниякоторой носиланезависимыйхарактер.

Низкийуровень объединениянаблюдалсямежду количественнымсодержаниеманкирином 2.3 ианкирином 2.1 и2.2 (r=0,278), актиноми белком полосы4.5 (r=0,327).

Рисунок 6

Дендрограммафенотипическихкорреляцийколичественногосодержаниягемоглобинаи основныхбелков мембранэритроцитовчеловека

N = 124 R(5%) = 0,176

/>

Группу кластеровсо среднимуровнем объединениясоставилианкирины 2.1 и2.2 (r=0,434), глутатион-S-трансферазаи белок полосы4.5.1 (r=0,409), глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназаи белок полосы3 (r=0,370).

Высокийуровень объединенияимел местомежду количественнымсодержаниемa- иb-спектринов(r=0,506)

Самыйвысокий уровень объединения (r=0,595) соответствовалколичественномусодержаниюгемоглобинаи белков полосы7, основнымсоставляющимбелком которойявляется тропомиозин.

Обсуждение

На основе полученных данных установлено, что наиболеепредставительнымибелками в мембранахэритроцитовчеловека являютсяанионтранспортныйбелок полосы3, a- иb-спектрины, а также актин.Наименьшееколичественноесодержаниесоответствуетмембрансвязанномугемоглобину.Несмотря нато, что он содержитсяв мембранеэритроцитовчеловека вменьшем количестве, гемоглобиниграет важнуюроль как вобразованиии поддержаниистабильностицитоскелета, так и в механизмахферментативногокатализа ивнутриклеточнойтрансформацииэнергии.

Полученныеданные позволилипредположить, что в эритроцитарныхмембранахрассматриваемыебелки во взаимномварьированииих количественногосодержанияобразуют 4 группывзаимнокоррелирующихсистем. Причемкаждая из этихгрупп по отношениюк остальнымхарактеризуетсяотносительнойнезависимостью.

Согласнорезультатамнашего исследованияколичественноесодержаниегемоглобинанаиболее тесносвязано с содержаниемтропомиозина.О причинахэтого покасудить трудновследствиенедостаточногоколичестваданных, касающихсяэтого вопроса- в доступнойнам литературеон не получилдолжного освещения.Но мы надеемся, что полученныеданные послужатосновой длядальнейшейдетализациив изучениисвязи гемоглобинасо структурнымибелками.

Такимобразом, полученныенами данныесвидетельствуюто сложной структурнойи функциональнойвзаимосвязибелков в мембранахэритроцитов.

заключение

Цитоплазматическиемембраны эритоцитовчеловека играютключевую рольв обеспечениии регуляциифизиологическойактивностиэтих клеток.Специфическиефункции мембранобеспечиваетсложная структурнаяорганизация, главным компонентомкоторой являютсябелки.

Современныебиохимическиеи биофизические методы позволиливыделить практическивсе основныемембранныебелки эритроцитов, изучить ихбиохимическуюструктуру иосновные аспектыфункционирования.Вместе с темв научной литературене получилдолжного освещениявопрос о структуремембрансвязанногогемоглобина, о его связи соструктурнымибелками. Намибыла проведенаоценка количественногосодержаниягемоглобинаи основныхбелков мембранэритроцитовчеловека, таккак нормальноефункционированиемембраны определяетсяне толькоприсутствиембелковых компонент, но и их количественнымсодержанием.

Крометого был предпринятанализ взаимоварьированияколичественногосодержаниягемоглобинаи структурныхбелков. В ходеисследованиянами был установленфакт взаимозависимостиколичественногосодержаниягемоглобинаи тропомиозина.Результатыданного исследованиямогут служитьосновой длядальнейшейдетализациив изучениисвязи гемоглобинасо структурнымибелками. Намипланируетсяпровести рядисследованийс целью изученияколичественногосодержаниягемоглобинаи его взаимосвязисо структурнымибелками мембранэритроцитовне только внорме, но и приразличныхпатологическихсостояниях.С тем, чтобыпрогнозироватьнаряду с уровнемданных нарушенийих связь междусобой и влияниена них измененийокружающейсреды.

выводы

Количественное содержание гемоглобина в мембранах эритроцитов составляет 17,40±0,74 мкг на 1 мг общего белка мембран и является наименьшим, по сравнению с количественным содержанием остальных мембранных белков.

Вариабельность количественного содержания гемоглобина характеризуется достаточно высокой сопряженностью с количе37ственным содержанием белка полосы 7 – тропомиозина.

Литература

Балашов В.И., Резаев А.А., Ярыга В.В. Содержание гемоглобина и его дериватов в крови детей, проживающих в населенных пунктах санитарно-защитной зоны астраханского газового комплекса// Педиатрия. – 1995. — №2. – С.75-77.

Блюменфельд Л.А. Гемоглобин// Соросовский образовательный журнал. – 1998. — №4. – С.33-38.

Гааль Э., Медьеши Г., Верецки Л. Электрофорез в разделении биохимических макромолекул. – М. – 1982. – 446с.

Гончаренко М.С., Андрух Г.А., Рязанцев В.В. Белковый спектр эритроцитарных мембран в норме и при псориазе// Вестник дерматологии и венерологии. – 1989. — №3. – С.4-7.

Гончарова Е.И., Пинаев Г.П. Белки цитоскелета эритроцитов// Цитология. – 1988. – т.30, №1. – С.5-18.

Громов П.С., Захаров С.Ф., Шишин С.С., Ильинский Р.В. Двумерная карта мембранных белков эритроцитов человека// Биохимия. – 1988. – т.53, вып.8. – С.1316-1326.

Громов П.С., Шандала А.М., Ковалев Л.И., Шишкин С.С. Изучение белков мембран эритроцитов человека методом двумерного электрофореза// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 1986. — №7. – С.28-30.

Казеннов А.М., Маслова М.Н. Влияние мембранного скелета безъядерных эритроцитов на свойства транспортных АТФаз// Цитология. – 1991. – т.33, №11. – С.32-41.

Казеннов А.М., Маслова М.Н. Структурно-биохимические свойства мембраны безъядерных эритроцитов// Физиологический журнал СССР им. И.М.Сеченова. – 1987. – т.73, №12. – С.1587-1594.

Казеннов А.М., Маслова М.Н., Шагабодов А.Д. Роль белков мембранного скелета безъядерных эритроцитов в функционировании мембранных ферментов// Докл. АН СССР – 1990. – т.312. — №1. – С.223-226.

Лакин Г.Ф. Биометрия: Учебное пособие для биол. спец. Вузов – 4-е изд., перераб. и доп. – М.: Высш.шк., 1990. – 352с.

Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. – М.: Наука, 1981. – 288с.

Петренко Ю.М., Владимиров Ю.А. Роль поверхностных зарядов в поддержании осмотической резистентности эритроцитов// Гематология и трансфузиология. – 1987. — №10. – С.15-18.

Солодилова М.А. Роль генетических и средовых факторов в детерминации количественного содержания основных белков мембран эритроцитов человека/ Дис. на соискание ученой степени к.б.н. – М., 1999. – 160с.

Шандала А.М., Захаров С.Ф., Громов П.С., Шишкин С.С. Белковый состав мембран эритроцитов человека, фракционных в ступенчатом градиенте декстрана// Гематология и трансфузиология. – 1987. — №10. – С.28-31.