Реферат: Авидин-биотиновая реакция в иммуноанализе

Авидин-биотиноваяреакциявиммуноанализе

Введение

Впоследние годыв качествеальтернативырадионуклидамв иммуноанализенашли широкоеприменениенеизотопныеметки, в томчисле ферменты, хемилюминесцентныесоединения, флуорофорыи коллоидныечастицы. Применениенеизотопныхмаркеров затрудняетсянеобходимостьюсинтезировать, очищать иохарактеризовыватьбелковые конъюгатыв случае каждогоопределяемоговещества. Ранеесистема авидин– биотин нашлаширокое применениепри локализации, обнаружениии очистке белков.Оказалось, чтоэта системане менее полезнаи в иммуноанализе.

Вработе детальнорассмотреныдва подхода, с помощью которыхавидин-биотиноваяреакция можетбыть использованав двухцентровомиммуноанализе.В обоих подходахприменялипрепаратыиммобилизованныхи биотинилированныхантител. Этипрепаратыотбирали попринципураспознаванияразличныхэпитопов антигена.В первом подходесначала иммобилизованныеантитела вводилив реакцию сисследуемымобразцом ибиотинилированнымиантителами.Затем добавляликонъюгат авидинаили стрептавидинас ферментомили с хемилюминесцентныммаркером. Вовтором подходевместо белковогоконъюгатадобавлялисвободныйавидин илистрептавидини затем добавлялибиотинилированныйфермент. В обоихслучаях определениеосуществлялиспектрофотометрическиили по интенсивностилюминесценциипосле добавлениясоответствующихсубстратов.В качествебиотинилированныхферментов-маркеровприменялипероксидазухрена, АВ+-зависимыеферменты, АТР-зависимыеферменты, пенициллиназуи щелочнуюфосфатазу.Рассмотримнекоторыерезультаты, полученныес помощью этихдвух подходов.

Основныепринципы

Ужедавно известно, что для обеспечениясильноговзаимодействиябиотина сгликопротеиномяичного белкаавидином требуетсятолько уреидноскольцо витамина.Следовательно, карбоксильнуюгруппу остаткавалериановойкислоты в биотинеможно модифицироватьи таким образомполучать активныебиотинилированныепроизводные.В частности, биотин, связанныйс макромолекулой, сохраняетспособностьсвязыватьсяс активнымцентром авидина.Посколькумолекула авидинасостоит изчетырех идентичныхсубъединиц, то с ней могутбыть одновременносвязаны остаткибиотина двухразличныхбиотинилированныхбелков. Этисвойстваавидии-биотиновогокомплексашироко используютсядля решенияразличныхзадач, в томчисле 1) обнаружения, локализациии очистки белков, углеводов инуклеиновыхкислот; 2) разработкиметодов двухцентровогоиммунометрическогоанализа; 3) картированияэпигонов вгибридомнойтехнологии.

Практическоеприменениеавидин-биотиновойсистемы ограничиваетсявысокой основностьюавидина и наличиемв его молекулеуглеводныхостатков, чтов свою очередьобусловливаетвысокий уровеньнеспецифическогосвязывания.Более 20 лет назадв бактерияхStreptomycesavidiniiбылобнаружендругой биотинсвязывающийбелок, названныйстрептавидином.Подобно авидинуяичного белка, стрептавидинтакже образуеточень прочныйи специфическийнековалент-ныйкомплекс сбиотином исостоит изчетырех идентичныхсубъединиц.Каждая субъединицасодержит одинбиотинсвязываюшийцентр. В отличиеот авидинастрептавидиннегликозилировани имеет нейтральнуюph.Авидин и стрептавидинсильно различаютсяпо аминокислотномусоставу, хотяоба богатыостаткамитриптофана.Некоторыесвойства этихбелков приведеныв табл. 1.

Таблица1. Некоторыехарактеристикиавидина истрептавидина

Характеристики

Авидин

Стрептавиднн

tМолекулярная масса

67 000

60 000

Мол. масса субъединицы

15 600

14 600 .

Kd(авидин-биотиновый комплекс), М

-10-15

-10-15

Еш(1 мг/мл)

1,54

3,4

Связывание биотина на субъединицу

1

1

Олигосахариды на субъединицу

1

Манноэа на субъединнцу

4-5

GlcNAc*ва субъединицу

3

Иэоэлектрическая точка,pi

>10

<7

Остатки аминокислот на субъеднницу

Триптофавы

4

8

Тироэины

1

6

Лиэины

9

4

Аргинины

8

4

Аспарагин + аспарагиновая кислота

15

12

Глутамин + глутаминовая кислота

10

9

Амиды

16

-

Стрептавидинможно использоватьвместо авидинаили в дополнениек нему в авидин-биотиновыхсистемах. Онкоммерческидоступен, и, подобно авидину, его можно очищатьс помощью аффиннойхроматографиина иминобиотиновойколонке. Посколькубактериальныйбелок имеетнейтральнуюизоэлектрическуюточку и не содержитуглеводныхостатков, тодля него нехарактернынеспецифическиевзаимодействия, свойственныеавидину яичногобелка. Хотянеспецифическоесвязываниеавидина можносвести к минимумус помощью химическихили каких-либодругих методов, стрептавиднни его конъюгатыявляются наилучшимрешением этойпроблемы.

/>

Влабораториидля разработкиразличныхметодов иммуноанализаприменяютсяимеющиеся впродаже конъюгатыавидина с ферментами, а также синтезированныепрепаратыбиотинилированныхбелков и стрептавидинас хемилюминесцентнойметкой.

Получениебиотинилированныхбелков

Антителаи ферментыбиотинилировалипо ранее описаннойметодике сиспользованиемN-гидроксисукцинимидныхэфиров производныхбиотина с различнойдлиной алкильнойцепи. Структурареагентов исхема реакциипредставленына рис. 2. Качествополученныхпрепаратовпроверяли спомощью ELISAили двухцентровогоиммунометрическогоанализа.

Получениебелков с хемилюминесцентнойметкой

Стрептавидннили очищенныефракции IgGмоноклональныхантител обрабатывалисукцинимиднымипроизводнымиаминобутилэтилизолюминола.Полученныеконъюгатыочищали гельфильтрациейна сефадексеG-25и хранили при-20°С.

/>

Методыанализа

Приразработкеметодов двухцентровогоиммунометрическогоанализа белковприменялимеченые конъюгатыавидина илистрептавидиналибо стрептавидинкак связующеезвено междубиотинилированнымиантителамии биотинилированнымферментом.Величину сигналав ферментативнойреакции какв том, так и вдругом случаеопределялиспектрофотометрическиили по интенсивностилюминесценциив зависимостиот типа используемойметки.

Авидини стрептавидинв качествемеченых зондов

Принципиальнаясхема этогометода представленана рис. 3.Исследуемыйобразец инкубировалис высокоаффиннымимоноклональнымиантителами, ковалентносвязаннымис полистирольнымишариками диаметром6,5 мм.Затем в системувводили биотинилированныеантитела кдругим эпитопамантигена. Позавершениииммунологическойреакции добавлялиавидин, меченныйферментом, илисодержащийхемилюминесцентнуюметку стрептавидин.В зависимостиот используемогомаркера измерениеосуществлялиспектрофотометрическиили по интенсивностилюминесценции.

/>

Определениес помощьюспектрофотометрии

Дляизучения влияниядлины цепимежду молекулойбиотина имоноклональнымантителом начувствительностьанализа применялисистему, в которойизбыток моноклональныхаити-hGHантител былковалентносвязан с полистирольнымигранулами.Гранулы инкубировалисо стандартнымипрепаратамиили с пробамии с двумя различнымипрепаратамибиотинилированныхмоноклональныхhGH-антител, различающимисядлиной цепи, соединяющеймолекулу биотинаи антитела. Позавершенииреакции антиген– антитело всистему добавляликонъюгатавидин– щелочнаяфосфатаза исмесь инкубировалив течение 30 мин.Растворы упаривалив токе воздуха, добавлялисубстратм-нитрофенилфосфати смесь инкубировали45 мин при 37°С.

/>

Образовавшийсяпродукт ферментативнойреакции определялипо поглощениюпри 405 нм. Экспериментальныеданные представлялив виде графиказависимостилогарифмаоптическойплотности отлогарифмаконцентрацииhGH.Полученныеданные свидетельствуют, что более крутойнаклон наблюдаетсяв случае антителклона №69, биотинилированныхс помощьюN-гидроксисукцинимидногоэфира с длиннойцепью CONH3-).Чувствительностьанализа, достигаемаяс длинноцепочечнымибиотинилированнымиантителамиклона №69, сравнимас чувствительностьюопределениягормона с помощьюобычногоконкурентногоРИА.

/>

Определениепутем измеренияинтенсивностилюминесценции

Кромеспектрофотометриидля определениясвязанныхбиотинилированныхантител мытакже использовалиизмерениеинтенсивностилюминесценции.На этом рисункесимволом Lобозначенхемилюминесцентныймаркер, а моноклональныеантитела к hGHбиотинилироваличерез длиннуюцепочку CONH3-).Вданном методемоноклональныеантитела, связанныес полистирольнымигранулами, инкубировалисо стандартамиили пробамии с длинноцепочечнымипроизводнымибиотинилированныхантител анти-hGHпри комнатнойтемпературе.

Позавершениииммунологическойреакции добавлялистрептавидин, несущий хемилюминесцентнуюметку. Через30 мин гранулыпромывали.Интенсивностьсвечения связаннойметки регистрировалипри щелочномрН с использованиемсистемы микропероксидаза– пероксидводорода.Калибровочныйграфик зависимостилогарифмаинтенсивностихемилюминесценцииот логарифмаконцентрацииhGHпредставленна рис. 5. Пределобнаружениягормона с помощьюданного методасоставляет3-10-5м.ед. hGH/лили 1,5 пг в пробирке, а рабочий диапазон– от 4–10-5до 10-1м.ед. hGH/л.Коэффициентвариации анализавнутри серииравен 5,5%.

/>

Нормальныйуровень hGHи его динамическиеизменения приискусственнойстимуляцииу здоровыхпациентовопределялис помощью обычногоРИА и двухцентровогоиммунометрическогоанализа. Коэффициенткорреляцииобоих методовсоставил 0,96. Крометого, методИХМА позволилопределитьуровень базальнойсекреции ислабые измененияконцентрацииhGHв плазме кровиу больныхгипопитуитаризмомв течение циркадногоцикла, что невозможносделать с помощьюобычного РИА.Полученныеданные показывают, что люминесцентныйИХМА в 10 раз болеечувствителен, чем существующиерадио- и иммуноферментныеметоды определенияhGH.

/>

Стрептавидини биотинилированныеферменты какзонды

Принципиальнаяпоследовательностьопераций в этомметоде представленана рис 7. Связанныес носителеми биотинилированныемоноклональныеантитела инкубировалис пробой илистандартами.По завершениииммунологическойреакции последовательнодобавляли илистрептавидини биотинилированнующелочную фосфатазу, или ацетилированныйавидин и биотинилированнуюглюкозо-6-фосфатдегидрогеназу.В зависимостиот ферментавеличину сигналарегистрировалиспектрофотометрическиили по интенсивностилюминесценции.Примером такогоподхода можетслужить определениеhGHс помощьюиммобилизованныхна полистирольныхгранулахмоноклональныхантител анти-hGHи модифицированныхдлинноцепочечнымпроизводнымбиотина антителанти-hGHклона №69. Гранулыотмывали ипоследовательноинкубировалипри комнатнойтемпературесо стрептавидиноми длинноцепочечнымпроизводнымбиотинилированнойщелочной фосфатазы.После промывкидобавлялирастворj-нитрофенилфрсфата.Образованиепродуктарегистрировалипо поглощениюпри 405 нм. Калибровочныйграфик дляопределенияhGH, полученныйс помощьюбиотинилированнойщелочной фосфатазыи спектрофотометрическогоопределенияпродуктаферментативнойреакции, представленна рис. 8.

/>

/>

Чувствительностьанализа сравнимас чувствительностьюметодов типаРИА. Коэффициентвариации внутрисерии при анализесмешаннойплазмы с концентрациейhGH7.6–10"3м.ед./л равен6,5%, а коэффициентвариации междусериями прианализе тогоже пула – 7,4%.

Нарис. 9 приведенырезультатыанализа образцовплазмы, взятыху пациентов, подвергнутыхтесту «на стимуляциюсекреции гормонароста. Полученныеданные свидетельствуют, что с помощьюэтого методаможно регистрироватьи количественноопределятьреакцию в тестахпо стимуляциии подавлениюсинтеза hGH, проводимыхдля оценкирезервов гормонав гипофизе. Всеприменявшиесяв этом методереагенты устойчивыв течение поменьшей мередвух лет. Диапазонкалибровочнойкривой позволяетопределятьв одном анализевысокие и низкиеконцентрацииhGH.

Заключение

Сравнительныеданные для двухметодов двухцентровогоиммунометрическогоанализа hGHприведены втабл. 2. Чувствительностьиспользованногодля сравненияметода РИАсоставляла0,6–10-3м.ед./л, а рабочийдиапазон –10-3м.ед./л.