Лекция: ИНТЕНСИФИКАЦИЯ ПРОЦЕССОВ ПОЛУЧЕНИЯ СПИРТА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ

Для интенсификации процессов получения спирта в настоящее время используют новые технологические приемы: приготовление и сбраживание высококонцентрированного сусла (22 % СВ), меха­нико-ферментативная обработка сырья без использования пара повышенного давления, гидротермическая обработка зерна.

Одним из резервов повышения эффективности сбраживания высококонцентрированного сусла является подбор полифермент­ного комплекса, обеспечивающего биоконверсию всех высокомо­лекулярных соединений зернового сырья, что позволит более ра­ционально использовать все составные компоненты зерна, интен­сифицировать процессы дрожжегенерации и брожения, снизить потери сырья, повысить выход целевого продукта — этанола.

Гидролиз целлюлозы и гемицеллюлоз не только дает непо­средственно сбраживаемую глюкозу, но и повышает доступность крахмала ферментативному гидролизу, поэтому особенно важно гидролизовать р-1,3—1,4-глюкан, который является существен­ным элементом клеточных стенок эндосперма злаков (у ячменя и овса глюкан составляет 75 % массы клеточных стенок эндоспер­ма). В свою очередь гидролиз крахмала способствует повышению доступности целлюлозы, и в присутствии амилолитических фер­ментов степень расщепления целлюлозы несколько повышается. Поэтому целлюлазные и гемицеллюлазные ферментные препара­ты целесообразно применять на стадии осахаривания замесов, совместно с α-амилазой и глкжоамилазой.

Отечественные ферментные препараты Целлофторин ГЗХ, Целлобранин ГЗХ, Ксилоглюканофоетидин П10Х и Целлюлаза-100 способны гидролизовать целлюлозу и гемицеллюлозы обогащенных этими полимерами фракций зерна; в оптимальной дозировке целлюлаз 14—1 бед/г субстрата при температуре 60°С они за 2—4ч расщепляют целлюлозу на 50 %.

Во ВНИИПБТ разработан способ применения МЭК СП-1 на основе препаратов Амилоглюкаваморин ГЗХ, Целловиридин ГЗХ и Пектофоетидин ГЗХ для осахаривания крахмалистого сырья в производстве этанола. При оптимальной температуре осахаривания 56 °С дозировка МЭК СП-1 составляет 3 ед. глюкоамилазы, 0,69 ед. α-амилазы, 0,21 ед. ксиланазы и 0,09 ед. β-глюканазы на 1 г крахма­ла. Процесс осахаривания осуществляют непрерывным способом. Частично осахаренную массу направляют в бродильные аппараты, в которые добавляют также предназначенную для второй стадии осахаривания часть МЭК. Затем в бродильный чан вносят заранее приготовленные дрожжи. Брожение осуществляют периодическим методом в течение 72 ч. Осахаривание проводят в течение всего пе­риода брожения при температуре процесса брожения. При приме­нении МЭК и непрерывного процесса осахаривания выход этанола по сравнению с нормативным увеличивается и составляет 101,2 %.

При приготовлении сусла в аппаратах гидродинамической об­работки замесы нагревают лишь до 75...95°С, что позволяет со­хранить в недеградированном состоянии моносахара, аминокис­лоты, пептиды, органические кислоты, витамины и некоторую часть ферментативной активности. При низкотемпературной об­работке замеса крахмал не может быть полностью клейстеризован, часть его остается «сырым». В этих условиях необходимо исполь­зовать ферментативные комплексы, способные воздействовать на сырой крахмал, а-амилаза некоторых штаммов В. subtilis гидролизует сырой крахмал на 28—39 % в зависимости от его источника. В сочетании с глюкоамилазой такая а-амилаза гидролизует неклейстеризованный картофельный крахмал на 95 %.

Препараты целлюлаз и гемицеллюлаз вносят на стадии осаха­ривания в сочетании с α-амилазой и глюкоамилазой в дозировках соответственно 1,5 и 7,5 ед. на 1 г крахмала.

При сбраживании сырья с высоким содержанием β-глюканов (ржи, ячменя) рекомендуют применять препараты β-глюканазы не только для осахаривания, но и для разжижения замеса при общем расходе в смесителе и осахаривателе от 3 до 6 ед. β-глюканазы на 1 г сырья. В качестве препаратов β-глюканазы могут использовать­ся Целловиридин, Зимафилт, Вискозим, Ультрафло.

Интенсивное сбраживание сусла дрожжами возможно лишь при создании условий для их активного размножения. Лимитирующим фактором роста на гидролизатах сырья, полученных с применени­ем ферментов карбогидразного действия, является низкое содер­жание свободных аминокислот. С целью обогащения сусла ами­нокислотами используют ферментные препараты грибного проис­хождения, обладающие высокой экзопротеазной активностью. Фер­ментативный комплекс препаратов из культур различных штаммов Aspergillus oryzae (Проторизина, Амилоризина, Амилопроторизина) включает, наряду с эндопротеазами, экзопротеазы. Этот комплекс обеспечивает более глубокий гидролиз белка, чем комплекс бакте­риального препарата Протосубтилина, основная активность кото­рого определяется металлопротеазой (табл. 9.2).

В результате использования Амилопроторизина сусло обогаща­ется легко ассимилируемым аминным азотом, что существенно сказывается на физиологической активности дрожжевых клеток. При этом повышается не только плотность дрожжевой популяции (в 2 раза), но и бродильная способность, а также продуктивность клеток (на 20—25 %). Это особенно важно на первом этапе, когда скорость процесса, вероятнее всего, лимитируется количеством дрожжей и их состоянием. Значительно интенсифицируется и процесс спиртового брожения.

Для обеспечения максимального роста дрожжей и сокращения сроков брожения с 72 до 42—46 ч дозировка протеаз должна соот­ветствовать 5—8 ед. ПС/г белка при нормативном расходе сс-ами-лазы и глюкоамилазы (1,5ед. АС и бед. ГлС на 1 г крахмала). Интенсификация процесса брожения происходит как на стадии главного брожения, так и при дображивании.

Для осуществления стандартного трехсуточного брожения воз­можно снижение расхода глюкоамилазы вдвое (3 ед. ГлС вместо 6 ед. ГлС на 1 г крахмала).

Дрожжевые клетки синтезируют аминокислоты из неоргани­ческого азота, используя при отсутствии необходимых амино­кислот углеродный скелет сбраживаемых углеводов. Обогащение питательной среды свободными аминокислотами способствует со­кращению расхода сахара на построение биомассы дрожжей и об­разование побочных продуктов брожения, что приводит к увели­чению выхода этанола. Данный эффект достигается в результате прямой ассимиляции аминокислот из окружающей среды. Введе­ние в процесс протеолитического комплекса, содержащего актив­ные экзопротеазы, приводит к увеличению выхода основного про дукта на 2,8 % и снижению образования побочных метаболитов на 19 %. На единицу дрожжевых клеток приходится в 2,4 раза меньше побочных продуктов, чем в контроле (табл. 9.3). Отмеченное сни­жение концентрации синтезируемых метаболитов подтверждает возможность прямой ассимиляции аминокислот дрожжами.

Увеличение выхода спирта объясняется снижением расхода са­хара на рост биомассы дрожжей и образование побочных про­дуктов брожения, повышением конечной степени сбраживания за счет более полного и глубокого гидролиза крахмала, а также использованием углеродного скелета аминокислот на биосинтез этанола.

Не менее важное значение для увеличения производительности спиртового производства при сбраживании сусла с повышенной концентрацией сухих веществ имеет его обогащение ассимилиру­емым аминным азотом под действием подобранного протеолитического комплекса. Дрожжи, выращенные на таком сусле, облада­ют повышенной осмофильностью и толерантностью к продуктам брожения и сбраживают за 72 ч сусло с 22 % сухих веществ с тех­нологическими показателями, соответствующими варианту, где использовали сусло с 16 % сухих веществ.

Исследование 15 ферментных препаратов отечественного и за­рубежного производства, гидролизующих крахмальные и некрах­мальные полисахариды и белковые соединения зернового сырья (табл. 9.4), позволило установить состав оптимальной ферментной системы и технологические параметры трехстадийного разжиже­ния концентрированных замесов:

Введение разжижающих ферментов осуществляют на первой стадии процесса. Возможно дробное введение препарата термо­стабильной а-амилазы: 0,3 ед. АС на первой стадии и 0,1 ед. АС на третьей стадии процесса. Высокая степень и однородность помо­ла, низкий гидромодуль при получении замеса с частичным ис­пользованием фильтрата барды и применение разжижающих фер­ментов определяют основу ресурсосберегающей технологии пере­работки зерна на спирт на начальном ее этапе.

Максимальная степень осахаривания крахмала достигается при использовании 24 ед. ГлС на 1 г крахмала за 6—8 ч гидролиза, при этом через 4 ч степень гидролиза составляет 80 %. При снижении дозировки до 8 ед. ГлС на 1 г крахмала эта же степень гидролиза достигается за 10—12 ч.

Из ферментных систем, способных к глубокому гидролизу высококонцентрированных сред, наибольшей гидролитической способностью обладает система, в состав которой наряду с а-амилазой и глюкоамилазой входит комплекс грибных протеаз, напри­мер Амилопроторизина. Гидролиз белковых соединений повы­шает атакуемость крахмала амилолитическими ферментами, что положительно сказывается на скорости и глубине осахаривания. В этом случае степень гидролиза крахмала составляет 86,5 %, со­держание редуцирующих сахаров — 19,4, глюкозы — 15,7 %; кон­центрация аминного азота в среде увеличивается в 1,5 раза.

Продолжительность спиртового брожения и выход спирта за­висят от степени подготовки зернового сырья и применяемых ферментных препаратов.

На стадии осахаривания концентрированного пшеничного сус­ла используют препараты: Амилосубтилин, БАН, Фунгамил — ис­точники а-амилазы; Глюкаваморин, СанСупер — источники глюкоамилазы; Амилопроторизин, Алкалазу — источники протеаз, из расчета 1 ед. АС, 6 ед. ГлС на 1 г крахмала и 0,3 ед. ПС на 1 г сы­рья. Разжижение пшеничного замеса (гидромодуль 1: 2) осуществ­ляется по разработанной схеме.

Применение указанных ферментных комплексов для осахаривания крахмала в концентрированных средах положительно влия­ет также на физиолого-биохимическую активность и размножение дрожжей. Концентрация клеток дрожжей к 20 ч брожения состав­ляет 100—115 млн клеток в 1 см3, морфологическое и физиологи­ческое состояние дрожжей хорошее.

Применение протеолитических ферментов интенсифицирует процессы дрожжегенерации и спиртового брожения, что согласу­ется с данными о повышении осмофильности дрожжевых клеток при обогащении питательной среды аминным азотом. Это проис­ходит при использовании грибного протеолитического комплекса, содержащего экзопептидазы. Использование бактериальных про­теолитических ферментов менее эффективно.

Аналогичные закономерности установлены при использовании и других крахмалосодержащих субстратов. Однако при приготов­лении замесов и сусла из трудносбраживаемых видов сырья, таких, как рожь и ячмень, содержащих около 25 % некрахмалистых по­лисахаридов, в рекомендуемых комплексах ферментов необходи­мо увеличить дозировку ксиланазы и β-глюканазы.

Таким образом, эффективное сбраживание концентрирован­ного зернового сусла достигается на основе использования комп­лексных ферментных систем широкого спектра действия путем улучшения реологических свойств замеса и сусла, повышения продуктивности клеток дрожжей, что обеспечивает ускорение про­цесса брожения.

Введение пуллуланазы в составе амилолитического комплекса позволяет повысить степень осахаривания крахмала с образовани­ем растворимых углеводов (11,9—14,5 % против 9—12,8 % в конт­роле) и снизить дозировку глюкоамилазы на осахаривание. При этом имеет место тенденция к увеличению выхода спирта.

Во ВНИИПБТ подобран комплекс ферментов, обеспечиваю­щий интенсификацию сбраживания пшеничного сусла, состоящий из глюкоамилазы, пуллуланазы и грибных протеаз (табл. 9.5).

Использование подобранных комплексов способствует сниже­нию сроков сбраживания пшеничного сусла до 42 ч (17 % СВ) и 62 ч (24 % СВ). Пуллуланаза, входящая в комплекс, позволяет по­высить степень и скорость гидролиза крахмала в результате более полной деструкции амилопектина и повышения эффективности действия глюкоамилазы.

Реологические биохимические характеристики ржаного и яч­менного сусла, а также показатели бражки зависят от концентрации гемицеллюлаз. Оптимальные дозировки β-глюканазы, ксиланазы и целлюлозы обеспечивают эффективное сбраживание сусла с одновременным увеличением выхода спирта. Поскольку ячмень отличается от других зерновых культур высоким содержанием клетчатки (до 8 %), наряду с β-глюканазой и ксиланазой вводят целлюлазу.

В результате гидролиза глюканов сырья происходит дополни­тельное высвобождение глюкозы, что способствует повышению выхода спирта. Ксиланолитическое действие фермента оказывает более существенное влияние на реологические свойства сусла, вязкость которого под действием этого фермента снижается более чем в 2 раза. При этом суммарное воздействие этого комплекса на полноту его сбраживания более эффективно, чем суммируемое действие ферментов комплекса, используемых по отдельности: выход спирта увеличивается на 2,6 % против 1,6. Введение протеаз в состав указанного комплекса в дозировке 0,05 ед. ПС/г сырья еще в большей степени способствует интенсификации процесса брожения и увеличению выхода спирта на 3,2 %.

Для получения ячменного сусла основными ферментами ком­плекса, как и в случае использования ржи, являются ксиланаза и β-глюканаза. Применение целлюлазы может быть рекомендовано в случае переработки сырья с повышенным содержанием целлюло­зы. Введение протеаз в состав комплекса (0,05 ед. ПС на 1 г сырья) также способствует повышению степени сбраживания ячменного сусла (табл. 9.6).

Ферментные препараты Амилопроторизин КФПА, Ксилоглюканофоетидин и Зимафилт — источники β-глюканазы, наиболее глубоко гидролизуют глюкан с образованием глюкозы, которая сбраживается дрожжами, что в итоге приводит к синтезу дополни­тельного количества этанола. Этим можно объяснить повышение • выхода спирта при сбраживании сырья, обработанного фермента­тивными комплексами, содержащими β-глюканазу.

Многопродуктовые схемы переработки зерна на этанол и кормопродукты позволяют решить проблему утилизации основного отхода спиртового производства — барды, что улучшает эколо­гическую обстановку на предприятии. Дифференцированное использование зерновки дает возможность снизить энергоза­траты на сушку барды и повысить качество этилового спирта. Однако существующие способы разделения зерна на фракции не позволяют выделить эндосперм без определенных потерь крах­мала, величина которых обусловлена реологическими свойства­ми сырья.

Новый способ биотехнологической обработки зерна перед ше­лушением с использованием ферментных препаратов целлюлаз и гемицеллюлаз позволяет снизить потери крахмала при фракцио­нировании и осуществить деструктуризацию некрахмальных по­лисахаридов.

Общая схема биотехнологического способа обработки зерна ржи перед шелушением включает следующие стадии: увлажнение зерна раствором ферментного препарата; отволаживание в тече­ние 3 ч при температуре, оптимальной для действия ферментов; сушка до исходной влажности; разделение на фракции перед ше­лушением (рис. 9.2).

Наилучшие результаты получаются при обработке зерна ржи ферментными препаратами Шеарзим 500Л и Ксилоглюканофоетидин П10Х при норме дозировки 10 ед. основной активности на 1 г некрахмальных полисахаридов. В этом случае содержание условного крахмала в эндосперме возрастает с 60,3 % в контроле (зерно шелушеное без обработки) до 66,7 и 66,86% соответст­венно.

Этот способ обработки зерна перед фракционированием в ре­зультате изменения реологических свойств зерновки позволяет не только снизить потери крахмала, но и изменить структуру некрах­мальных полисахаридов, что приводит к увеличению доли легкогидролизуемых фракций. Одновременное разрыхление внутрен­них слоев зерновки дает возможность снизить энергозатраты на измельчение.

Сбраживание сусла из ржи, прошедшей обработку фермент­ным препаратом Шеарзим 500Л, позволяет получить бражку с наибольшим содержанием алкоголя — 7,04 % (табл. 9.7).

Наряду с крахмалосодержащим сырьем можно использовать другие виды сырья: топинамбур, древесину быстрорастущих пород деревьев и др.

Топинамбур, по мнению отечественных и зарубежных спе­циалистов, — один из самых дешевых видов сырья для спирто­вой промышленности. Это весьма существенное его преиму­щество, так как спиртовая отрасль относится к материалоемким отраслям пищевой промышленности, в которой затраты на сырье и основные материалы составляют более 80 % общих затрат на производство.

Топинамбур относится к инулинсодержащему сырью. Кроме. преобладающих в количественном отношении потенциально доступных для сбраживания углеводов (инулина, инулидов, оли-госахаридов, фруктозы) в нем имеется достаточно азотистых ве­ществ, микро- и макроэлементов. Клубни богаты витаминами, в частности биотином, обладают активным комплексом ферментов, гидролизующих инулин.

Наиболее перспективный способ подготовки топинамбура к сбраживанию — ферментативный гидролиз инулина. Причем он может быть осуществлен как совместным действием собственных инулиназ сырья (они достаточно активны в топинамбуре), так и путем внесения в среду ферментных препаратов, обладающих дан­ной активностью, например комплексного ферментного препара­та цитолитического действия Ксилоглюканофоетидина, обладаю­щего высокой инулиназной активностью.

Наряду с крахмалосодержащим сырьем можно использовать другие виды сырья: топинамбур, древесину быстрорастущих пород деревьев и др.

Топинамбур, по мнению отечественных и зарубежных спе­циалистов, — один из самых дешевых видов сырья для спирто­вой промышленности. Это весьма существенное его преиму­щество, так как спиртовая отрасль относится к материалоемким отраслям пищевой промышленности, в которой затраты на сырье и основные материалы составляют более 80 % общих затрат на производство.

Топинамбур относится к инулинсодержащему сырью. Кроме. преобладающих в количественном отношении потенциально доступных для сбраживания углеводов (инулина, инулидов, олигосахаридов, фруктозы) в нем имеется достаточно азотистых ве­ществ, микро- и макроэлементов. Клубни богаты витаминами, в частности биотином, обладают активным комплексом ферментов, гидролизующих инулин.

Наиболее перспективный способ подготовки топинамбура к сбраживанию — ферментативный гидролиз инулина. Причем он может быть осуществлен как совместным действием собственных инулиназ сырья (они достаточно активны в топинамбуре), так и путем внесения в среду ферментных препаратов, обладающих дан­ной активностью, например комплексного ферментного препара­та цитолитического действия Ксилоглюканофоетидина, обладаю­щего высокой инулиназной активностью.

Перспективным видом сырья, которое может в значительной мере заменить крахмалосодержащее сырье, является целлюлоза. В настоящее время целлюлозосодержащее сырье после кислотно­го гидролиза используют для выработки технического этанола.

Сырьем для получения этанола-энергоносителя может служить измельченная древесина быстрорастущих пород деревьев (тополя, осины, ивы и др.), обработанная методом парового взрыва. Это кратковременное (1—10 мин) выдерживание увлажненного сырья, пропитанного сернистым газом, при температуре от 120 до 250 °С с последующим резким сбросом давления. Кратковременный гид­ролиз в кислой среде и механическое разрушение при сбросе дав­ления приводят к дезацетилированию и расщеплению гемицеллюлоз, переходящих в раствор, к выплавлению части лигнина и ослаблению лигноуглеводных связей. Взорванная лигноцеллю-лоза имеет развитую поверхность и хорошо подвергается ферментативному гидролизу. Препятствие к сбраживанию гидролизатов — наличие побочных продуктов деструкции древесины (ацетата, фурфурола и его производных, л-оксибензойной кис­лоты и др.), которые могут быть удалены промыванием сырья го­рячей водой.

Одним из потенциальных видов сырья для выработки этанола в средней полосе России является ива козья (Salix caprea). Измель­ченную древесину ивы обрабатывают паровым взрывом в течение 1 мин при 200 °С и концентрации сернистого газа 0,5 %. Взорван­ное сырье имеет влажность 40—50 %. Для гидролиза используют смесь растворов препаратов Целловиридина и Пектофоетидина после ультрафильтрации. Предельная степень конверсии сырья в глюкозу составляет для промытого водой сырья 74 %, для непро­мытого — 53 % при исходной концентрации сырья соответствен­но 27 и 21 %. Установлено, что оптимальная концентрация сырья для гидролиза составляет около 20 %. Перемешивания сырья в ходе гидролиза не требуется, поскольку целлюлолитические фер­менты находятся в сорбированном состоянии и скорость диф­фузии не лимитирует реакцию. Состав конечных продуктов гид­ролиза, %: глюкоза 70—76, ксилоза 12—14, целлобиоза 3 -11, гентиобиоза 1—3. Эффективный гидролиз сырья, заканчиваю­щийся при температуре 50 °С в течение суток, возможен при концентрации фермента не менее 20 ед. на 1 г СВ сырья. С целью экономии ферментов возможно использование для повторного гидролиза фракции слабоадсорбирующихся целлюлаз, которые выделяют из гидролизата ультрафильтрацией, что позволяет со­кратить расход ферментов до 8 ед. на 1 г СВ сырья и обеспечивает рентабельность процесса. Гидролиз взорванной древесины дает сиропы с содержанием глюкозы от 10 до 16 %, которые можно сбраживать в этанол.