Шпаргалка: Белки
БЕЛКИ
Любое соединение, которое содержитодновременно карбоксильную и аминогруппу, является аминокислотой.Однако, чаще этот термин применяется для обозначения карбоновых кислот,аминогруппа которых находится в a-положении к карбоксильной группе.
/>
Аминокислоты, как правило, входят всостав полимеров — белков. В природе встречается свыше 70 аминокислот,но только 20 играют важную роль в живых организмах. Незаменимыминазываются аминокислоты, которые не могут быть синтезированы организмом извеществ, поступающих с пищей, в количествах, достаточных для того, чтобыудовлетворить физиологические потребности организма. Незаменимые аминокислотыприводятся в табл. 1. Для больных фенилкетонурией незаменимой аминокислотойявляется также тирозин (см. табл. 1).
Таблица 1.Незаменимыеаминокислоты R-CHNH2COOH
Название (сокращение) R изолейцин (ile, ileu)CH3CH2CH(CH)3-
лейцин (leu)(CH3)2CHCH2-
лизин (lys)NH2CH2CH2CH2CH2-
метионин (met)CH3SCH2CH2-
фенилаланин (phe)C6H5CH2-
треонин (thr)CH3CH(OH)-
триптофан (try)/>
валин (val)(CH3)2CH-
тирозин (tyr)Аминокислоты называют обычно какзамещенные соответствующих карбоновых кислот, обозначая положение аминогруппыбуквами греческого алфавита. Для простейших аминокислот обычно применяютсятривиальные названия (глицин, аланин, изолейцин и т.д.). Изомерия аминокислотсвязана с расположением функциональных групп и со строением углеводородногоскелета. Молекула аминокислоты моет содержать одну или несколько карбоксильныхгрупп и в соответствии с этим аминокислоты различаются по основности. Также вмолекуле аминокислоты может находиться разное количество аминогрупп.
Аминокислоты способны кполиконденсации, в результате которой образуется полиамид. Полиамиды, состоящиеиз a-аминокислот, называются пептидамиили полипептидами. Амидная связь в таких полимерах называется пептиднойсвязью. Полипептиды с молекулярной массой не меньше 5000 называют белками.В состав белков входит около 25 различных аминокислот. При гидролизе данногобелка могут образовываться все эти аминокислоты или некоторые из них вопределенных пропорциях, характерных для отдельного белка.
Уникальная последовательностьаминокислотных остатков в цепи, присущая данному белку, называется первичнойструктурой белка. Особенности скручивания цепей белковых молекул(взаимное расположение фрагментов в пространстве) называются вторичнойструктурой белков. Полипептидные цепи белков могут соединяться междусобой с образованием амидных, дисульфидных, водородных и иных связей за счетбоковых цепей аминокислот. В результате этого происходит закручивание спирали вклубок. Эта особенность строения называется третичной структурой белка.Для проявления биологической активности некоторые белки должны сначалаобразовать макрокомплекс (олигопротеин), состоящий из несколькихполноценных белковых субъединиц. Четвертичная структураопределяет степень ассоциации таких мономеров в биологически активномматериале.
Белки делятся на две большие группы — фибриллярные (отношение длины молекулы к ширине больше 10) и глобулярные(отношение меньше 10). К фибриллярным белкам относится коллаген,наиболее распространенный белок позвоночных; на его долю приходится почти 50%сухого веса хрящей и около 30% твердого вещества кости. В большинстверегуляторных систем растений и животных катализ осуществляется глобулярнымибелками, которые носят название ферментов.
Для полипептидов существуетспециальная номенклатура. Аминокислота со свободной аминогруппой на концеполипептидной цепи называется N-концевой аминокислотой, а аминокислота со свободной карбоксильной группой надругом конце этой молекулы — С-концевой аминокислотой.Аминокислотные остатки в полипептидной цепи нумеруются по порядку, начиная с N-концевой аминокислоты, котораяобозначается цифрой 1. Полипептиды называются как производные С-концевойаминокислоты, причем первой пишут название N-концевой аминокислоты, а последней — С-концевуюаминокислоту. Так, глицилаланин — это дипептид, состоящий из глицина (N-концевая аминокислота) и аланина(С-концевая аминокислота). В сокращенном виде название пишут gly-ala. Аланилглицин (ala-gly) — это изомерный дипептид, в котором N-концевой аминокислотой является аланин, а С-концевой — глицин.
АНАЛИЗБЕЛКОВ
Белки, как и прочие амидыгидролизуются под действием кислот и щелочей. После полного гидролизаможно установить качественный и количественный аминокислотный состав, но неточную последовательность аминокислот. Если перед гидролизом обработатьполипептид реактивом Сэнгера, то можно будет затем идентифицировать N-концевую аминокислоту, так как онадаст устойчивое окрашенное производное анилина, которое не разрушается пригидролизе.
/>
В результате неполногогидролиза образуются небольшие пептидные фрагменты. Меняя условиягидролиза, можно разбивать полипептид на различные фрагменты, которыеперекрываются по составляющим их аминокислотным остаткам. Для воссоздания первичнойструктуры необходимо идентифицировать аминокислоты, которые входят в составкаждого из фрагментов, и определить последовательность, в которой этиаминокислоты соединяются друг с другом в исходном полипептиде. Для этого можнопровести полный гидролиз фрагментов, идентифицировать аминокислоты, а затемосуществить химический синтез фрагментов. Существует и другой путь — избирательныйгидролиз. В этом случае от фрагмента отщепляют по одной аминокислоте накаждом этапе, чаще всего при помощи ферментов поджелудочной железы (карбоксипептидаз).Эти ферменты способны гидролизовать только С-концевые аминокислоты и,следовательно, разрушать пептидный фрагмент с С-конца.
N-концевую кислоту можно удалить припомощи фенилизотиоцианата. В результате следующая аминокислота становится N-концевой, ее также можно отщепитьдействием фенилизотиоцианата и т.д. (деградация по Эдману).
/>
В результате реакциифенилизотиоцианата с N-концевойаминокислотой образуется аддукт (тиомочевина), который циклизуется в уксуснойкислоте. При кислотном гидролизе аддукт расщепляется, давая N-концевую аминокислоту и неустойчивоепромежуточное соединение, которое изомеризуется в тиогидантоин. Специфическийтиогидантоин служит для идентификации первой N-концевой аминокислоты. Проводя во второй раз всюпоследовательность реакций, можно определить следующую аминокислоту, так какона стала N-концевой в результате деградации поЭдману.
СИНТЕЗБЕЛКОВ
Реакции, протекающие при синтезе белка- см. Реакции аминокислот. Вышеприведенная схема допускает некоторые изменения- например, для активации карбоксильной группы вместо этилхлорформиатаиспользуют дициклогексилкарбодиимид. В любом случае, синтез белка по этой схеметребует нескольких стадий, что и служит ограничением использования этогометода.
Для синтеза белков стали применятьметод, впервые предложенный Р. Меррифилдом и получивший название твердофазногосинтеза пептидов (ТФСП). На первой стадии синтеза аминокислоту,которая будет стоять на С-конце будущего белка, присоединяют через еекарбоксильную группу к полимеру. При этом нередко используют образованиеэфирной связи между этой группой и хлорметильной группой полимера:
/>
Затем проводят ацилирование свободнойаминогруппы этой аминокислоты путем реакции с дициклогексилкарбодиимидом идругой аминокислотой, которая содержит защищенную аминогруппу. В результатеобразуется первая пептидная связь:
/>
После удаления трет-бутоксикарбонильнойгруппы и нейтрализации полимер, несущий пептид, готов для следующей стадииацилирования:
/>
Вслед за присоединением последнегоаминокислотного остатка аддукт полипептида и полимера обрабатывают смесьюбромистого водорода и трифторуксусной кислоты. В результате полипептидосвобождается от полимера, а с N-концевойаминокислоты снимается защитная группа.
Преимущество этого метода посравнению с классическими методами синтеза состоит в том, что ни на одной изстадий не требуется выделения полипептидной цепи. В силу чрезвычайно низкойрастворимости аддукта пептида и полимера легко отмывается после каждой реакцииот побочных продуктов, растворителей и избытка реагентов без потери пептида,после чего аддукт готов к следующей реакции. В настоящее время методавтоматизирован, и запрограммированные аминокислотные синтезаторы могутбез труда присоединить шесть аминокислот к растущей полипептидной цепи за 24 ч.Эти приборы добавляют реактивы в надлежащей последовательности, меняют условияреакций, обеспечивают необходимое время реакций, отмывают побочные продукты,после чего начинают операцию снова. С помощью метода ТФСП былисинтезированы инсулин и фермент рибонуклеаза, состоящий из124 аминокислот.