Реферат: Изучение достоверности результатов лабораторных исследований методами пиф и пцр при диагностике урогенитальной хламидийной инфекции

Изучение достоверности результатов лабораторных исследований методами ПИФ и ПЦР при диагностике урогенитальной хламидийной инфекции

Автор: Гущин А.Е., Ширшова Е.В., Цеслюк М.В., Кисина В.И. Шипулин Г.А.
Организация: ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора; ММА им. И.М. Сеченова

Ведение. Урогенитальная хламидийная инфекция (УГХИ) вызываемая Chlamydia trachomatis является наиболее частой ИППП и протекает у мужчин обычно в форме уретрита, а у   женщин в форме гнойно-серозного цервицита. Диагностика УХИ базируется на методах лабораторного исследования, поскольку клинические проявления носят неспецифический характер, и в значительном числе случаев инфекция протекает скрыто в субклинической форме, манифестируя уже на стадии развития осложнений.

Наиболее эффективными методами диагностики УГХИ в настоящее время во всем мире считаются методы амплификации нуклеиновых кислот (МАНК), которые обладают высокой чувствительностью, специфичностью и возможностью автоматизации, благодаря чему возрастает объективность оценки результатов исследования и возможность анализа большого количества клинических образцов. В нашей стране среди МАНК наибольшее распространение получил метод ПЦР, на основе которого несколькими производителями выпускаются коммерческие тест-системы. Кроме того, впервые в зарубежной и отечественной практике в ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора была разработана и прошла Государственную регистрацию тест-система на основе реакции транскрипционной амплификации НАСБА с детекцией в реальном времени (Рег. удост. № ФС 012б2006/5664-06 от 28 декабря 2006г). Однако, наряду с МАНК по-прежнему, особенно в Российской Федерации,  широко применяется метод прямой иммунофлуоресценции   (ПИФ), который относительно прост в исполнении и не требует специального дорогостоящего оборудования. Недостатком метода является невысокая диагностическая чувствительность и специфичность, которые в значительной степени зависят от качества получения клинического материала и опыта лабораторного персонала.

На сегодняшний день вместо регламентированного алгоритма лабораторного обследования при  диагностике УГХИ предлагается перечень существующих методов с указанием их диагностических характеристик [Козлова В.И., Пухнер А.Ф., 2003; Соколовский Е.В., Савичева А.М., 2006; Дерматовенерология 2007 Клинические рекомендации]. В связи с этим некоторые отечественные руководства [Макарова О.В., Алешкина В.А., Савченко Т.Н., 2007] рекомендуют для увеличения достоверности результатов лабораторного исследования на УГХИ использовать одновременно два метода, не учитывая, что методы, различающиеся по аналитическим характеристикам, могут приводить к несовпадающим результатам и только увеличивать трудности окончательного диагноза.

Целью проведенного исследования стало изучение объективности результатов при диагностике УГХИ  с использованием методов ПЦР и ПИФ.

^ Материалы и методы. Материалом для исследования служили соскобы из  уретры от 132 мужчин, проходивших клинико-лабораторное обследование на базе ММА им. И.М.Сеченова. От каждого пациента было получено не менее двух образцов, один из которых наносился на предметное стекло для дальнейшего исследования методом ПИФ, а другой образец помещался в транспортную среду для последующего исследования МАНК.  Для диагностики методом   ПИФ использовали коммерческую тест-систему «ХлаМоноСкрин» (ЗАО «НИАРМЕДИК ПЛЮС», Россия). Для выявления ДНК  C.trachomatis использовали тест-систему «Амплисенс Chlamydia trachomatis – FRT» на основе  ПЦР «в реальном времени», а для выявления РНК C.trachomatis  тест-систему на основе НАСБА «в реальном времени». Реакции амплификации ПЦР и НАСБА с детекцией флуоресцентного сигнала в реальном времени проводили в приборах RotorGene 6000 (Corbett Research, Австралия)

Результаты. Положительные результаты выявления C.trachomatis методом ПИФ были получены у 44 пациентов, а методом ПЦР – у 32 пациентов. Однако совпадение результатов ПИФ и ПЦР было только в 8  случаях. Таблица 1. 

 

Таблица1

 

Результаты исследования

Количество пациентов (n=132)

Положительный результат

Отрицательный результат

Неопределенный результат

Только ПЦР

24

36

-

Только ПИФ

19

16

25

Совпадение результатов ПЦР + ПИФ

 

8

 

64

 

-

 

Для  подтверждения результатов исследования методом ПИФ 30 стекол после исследования одним специалистом  были повторно исследованы другим независимым специалистом. Для подтверждения результатов ПЦР соответствующие клинические образцы были повторно разморожены и исследованы на наличие РНК C.trachomatis методом НАСБА. Результаты представлены в Таблице 2.

 

Таблица 2.

 

НАСБА

ПЦР

 

ПИФ 1

 

ПИФ 2

-

-

сомн.

+

-

-

сомн.

сомн.

+

+

-

+

-

-

+

-

-

-

+

+

-

-

+

-

-

-

сомн.

-

-

-

сомн.

+

+

+

сомн.

+

-

-

+

-

-

-

+

сомн.

-

-

сомн.

+

-

-

-

+

-

-

+

-

+

+

+

сомн.

+

+

-

+

-

-

+

-

-

-

сомн.

+

+

+

-

-

-

-

-

сомн.

-

-

+

+

+

+

-

+

-

-

+

+

+

+

-

+

-

-

+

+

+

+

сомн.

-

-

-

сомн.

-

+

+

сомн.

+

+

+

сомн.

-

+

+

-

+

 

«- » - обнаружено, «+» - не обнаружено, «сомн.» - результат сомнительный

 

Как видно из таблицы, результаты обоих МАНК совпали в 100% случаях, в то время как при использовании метода ПИФ результаты полученные первым специалистом (ПИФ1) в значительном числе случаев были интерпретированы иначе вторым специалистом (ПИФ2). Несмотря на то, что в 4-х случаях положительные результаты ПИФ, отмеченные обоими специалистами, не подтвердились результатами МАНК, данные совпадения из-за общего большого числа расхождений в оценках результатов ПИФ выглядят скорее случайными. Нельзя исключить, что в ряде случаев несовпадение результатов методов ПЦР и ПИФ есть следствие ошибок при получении клинического материала для исследования вторым методом, однако гораздо важнее то, что полученная в процессе исследования методом ПИФ цитологическая картина интерпретируется по-разному разными специалистами. 

Субъективность метода ПИФ отмечена давно. В 1986 г. Коллегия Патологов Америки инициировала комплексную оценку использования метода ПИФ для диагностики хламидийной инфекции проводимой разными лабораториями США. В отчетном докладе по результатам за 1986-1992гг. указывается на значительные расхождения в выполнении процедуры фиксации, учета количества элементарных частиц, необходимых для положительного заключения о наличии инфекции, используемых в работе антител. Снижение порога значимости ниже 10 флуоресцирующих включений в поле зрения приводило к снижению специфичности теста. Авторы отчета подчеркивают, что в значительной степени результаты зависели от подготовленности, опыта и  от длительности работы лабораторного персонала.

Заключение. Полученные данные позволяют рассматривать первично полученные результаты методом ПЦР как достоверные и отражающие наличие хламидий в исследуемых образцах. Комбинация двух методов ПЦР и НАСБА является наиболее адекватным подходом для верификации диагноза УГХИ. Использование метода ПИФ ввиду высокой субъективности и низкой аналитической чувствительности приводит к высокому числу как ложно-отрицательных, так и ложно-положительных результатов, что в одном случае   не позволяет своевременно диагностировать инфекцию и проводить этиотропную терапию, а в другом случае приводит к необоснованному диагнозу и назначению неоправданного лечения.