Реферат: На правах рукописи

На правах рукописи


РУДЕНКО

Виктория Владимировна


НОВЫЕ МАРКЕРЫ аномального метилирования ДНК

при РАКе МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ, ИДЕНТИФИЦИРОВАННЫЕ НЕПРЕДВЗЯТЫМ СКРИНИНГОМ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОГО МЕТИЛИРОВАНИЯ ГЕНОМОВ


03.02.07 "Генетика"


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук


Москва - 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук


^ Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент Стрельников Владимир Викторович


Официальные оппоненты:

Ревазова Юлия Анатольевна, доктор биологических наук, профессор,

Федеральное бюджетное учреждение науки «Федеральный научный центр гигиены им.Ф.Ф.Эрисмана» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации, ведущий научный сотрудник


^ Сальникова Любовь Ефимовна, доктор биологических наук,

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, ведущий научный сотрудник лаборатории экологической генетики


^ Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации


Защита диссертации состоится " "________________ 2012 г.

в___час. на заседании Диссертационного Совета Д 001.016.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук (115478, Москва, ул. Москворечье, 1)


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.


Автореферат разослан " "________________ 2012 г.


Учёный секретарь диссертационного совета Д 001.016.01

по защите докторских и кандидатских диссертаций,

доктор медицинских наук, профессор Зинченко Рена Абульфазовна
^ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Задачами онкогеномики являются изучение молекулярных механизмов канцерогенеза и разработка эффективных методов диагностики, прогноза течения, оптимизации лечения и мониторинга рецидивирования опухолей. Процесс злокачественной трансформации клеток характеризуется накоплением большого количества повреждений в геноме опухолевой клетки. Нарушение функционирования генов, вовлеченных в процессы канцерогенеза, связывают как со структурными повреждениями, так и с эпигенетическими аномалиями, к числу которых относится, в частности, гиперметилирование ДНК в регуляторных областях генов (Esteller M. et al., 2001). Анализ маркеров метилирования на сегодняшний день является оптимальным инструментом молекулярно-генетической диагностики и мониторинга в онкологии. По специфичности он не уступает анализу экспрессии генов, значительно превосходя последний по простоте и доступности. Что же касается анализа структурных аномалий, то это остается достаточно дорогостоящей процедурой и находит применение в основном в диагностике наследственных онкологических синдромов и для выявления стандартных мутаций, определяющих чувствительность опухолей к тем или иным химиопрепаратам (Васильев Е.В. с соавт., 2009; Бабенко О.В. с соавт., 2009; Алексеева Е.А. с соавт., 2012).

Анализ метилирования ДНК имеет ряд преимуществ перед детекцией мутаций при выявлении клеток рака в образцах тканей или свободной ДНК из опухолевых клеток в биологических жидкостях. Во-первых, частоты аномального метилирования CpG-островков множества генов значительно превышают частоты структурных повреждений тех же генов при канцерогенезе (Kaneda A. et al., 2002; Miyamoto K. et al., 2003). Во-вторых, выявление аномально метилированных молекул ДНК в избытке нормального биологического материала не вызывает значительных проблем, детекция же мутаций/делеций в этой ситуации практически невозможна. В-третьих, анализ метилирования технически прост и в большинстве случаев сводится к ПЦР одного локуса. Поиск мутаций в одном гене требует анализа многих локусов; кроме того, 100%-ная эффективность достигается только после секвенирования фрагментов ПЦР. Наконец, аномальное метилирование наблюдается в пренеопластических тканях и может служить одним из наиболее ранних маркеров канцерогенеза (Esteller M. et al., 2001).

Несмотря на диагностические преимущества маркеров метилирования ДНК, они до сих пор не получили широкого распространения в клинической онкологии. Это объясняется, в частности, недостатком хорошо изученных и охарактеризованных генов, аномальное метилирование которых достоверно связано с тем или иным патоморфологическим типом опухоли (Jones P. et al., 2007). В связи с этим особое значение приобретает идентификация и подробная характеристика особенностей метилирования новых геномных локусов, непосредственно или опосредованно вовлеченных в канцерогенез, что в значительной степени определило цель и задачи настоящей работы.

Первое место в структуре смертности от онкологических заболеваний у женщин занимает рак молочной железы (Давыдов М. И. с соавт., 2007). Чрезвычайная гетерогенность молекулярно-генетических характеристик этого заболевания находит свое отражение на клиническом уровне. Рак молочной железы характеризуется крайне разнообразным клиническим течением – от агрессивного до вялотекущего с поздним и редким метастазированием (Ермилова В.Д., 2002). Выраженная гетерогенность на клиническом, гистопатологическом и молекулярном уровнях привела к созданию многочисленных маркеров заболевания, которые, тем не менее, не всегда обеспечивают достаточный уровень эффективности диагностики. Это объясняет необходимость разработки более современных мультигенных панелей маркеров, в том числе и панелей маркеров метилирования (Maier S. et al., 2007; Widschwendter M. et al., 2008). Современные исследования говорят о принципиальной возможности использования как панелей маркеров, так и единичных маркеров метилирования в качестве прогностических и предиктивных при раке молочной железы (Hartmann O. et al., 2009). Использование оптимизированого метода непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов в исследованиях рака молочной железы уже привело к выявлению целого ряда новых маркеров (Кузнецова Е.Б. с соавт., 2007), которые в настоящее время активно изучаются как с точки зрения участия в процессах канцерогенеза, так и с точки зрения диагностических приложений (Rutella, S. et al., 2009; Hawes S.E. et al., 2010; Wang Y., Rekaya R., 2010). Разработка и внедрение более современных протоколов скрининга дифференциального метилирования и характеристики новых маркеров аномального метилирования должны повысить эффективность создания систем диагностических маркеров рака молочной железы.

^ Цель работы. Сформировать систему диагностических маркеров рака молочной железы, используя унифицированный метод выявления и характеристики новых локусов генома, аномально метилированных в процессе канцерогенеза.

^ Задачи исследования.

1. Разработать модификацию лабораторного протокола амплификации интерметилированных сайтов для непредвзятого скрининга дифференциального метилирования ДНК.

2. Идентифицировать новые дифференциально метилированные геномные локусы в злокачественных опухолях, тканях, пограничных с опухолью, и аутопсийном материале молочной железы.

3. Оценить частоты метилирования выявленных геномных локусов в злокачественных опухолях, тканях, пограничных с опухолью, и аутопсийном материале молочной железы.

4. Охарактеризовать корреляции дифференциального метилирования выявленных локусов с клинико-морфологическими характеристиками опухолей молочной железы.

5. Предложить систему маркеров метилирования для диагностики рака молочной железы, оценить параметры её чувствительности, специфичности и достаточности состава маркеров с точки зрения молекулярной классификации образцов клинического материала.

^ Научная новизна.

В результате проведенного исследования разработана модификация метода непредвзятого скрининга дифференциального метилированния геномов, применение которой позволило выявить 4 константно метилированных и 19 дифференциально метилированных областей генома. Дифференциальное метилирование при раке молочной железы впервые показано для 15 генов: ^ LAMB1, RAI1, KCNH8, DOCK6, GPC2, SH3KBP1, PPP2R5C, PHF15, ATMIN, C2CD2, KIAA1324L, IQSEC2, AX746725/AK127124, TMEM176A/TMEM176B, FOXM1/HKMT1188. Четыре дифференциально метилированные области впервые выявлены в межгенных областях на хромосомах 1p33, 5p15.33, 12q13.13 и 13q32.1. В выборке 140 образцов РМЖ проведена оценка частот аномального метилирования указанных локусов. Особенности метилирования выявленных областей охарактеризованы впервые.

Впервые продемонстрированы ассоциации метилирования CpG-островков генов SH3KBP1, PHF15, GPC2 и LAMB1 с клинико-морфологическими свойствами опухолей молочной железы. Промоторы SH3KBP1 и PHF15 достоверно чаще метилированы в опухолях со второй степенью злокачественности по сравнению с третьей степенью злокачественности. В то же время CpG-островок гена GPC2 обнаруживает различия уже в пределах второй степени злокачественности, что говорит о субъективизме критерия «степень злокачественности» и недостаточности только морфологических характеристик для его определения. Также показано, что ген SH3KBP1 достоверно чаще метилирован в группе опухолей молочной железы с размером Т1 против опухолей с размером Т2. Метилирование промоторного CpG-островка гена LAMB1 в образцах рака молочной железы ассоциировано с негативным иммуногистохимическим статусом эстрогеновых рецепторов.

Сформированы оригинальные системы маркеров метилирования для диагностики рака молочной железы, демонстрирующие высокие показатели чувствительности и специфичности. Показано, что для формирования системы, обеспечивающей молекулярную классификацию тканей молочной железы со специфичностью 100%, достаточно семи маркеров метилирования.

^ Теоретическая и практическая значимость.

Выявленные дифференциально метилированные локусы и разработанная система скрининга дифференциального метилирования геномов позволяют проводить сравнительные исследования паттернов метилирования ДНК в норме и при злокачественных новообразованиях. Предложенный дизайн адаптер-опосредованной метилчувствительной полимеразной цепной реакции позволяет определять в формате реакции в одной пробирке состояние метилирования 7 геномных локусов, составляющих систему маркеров диагностики рака молочной железы, различающую злокачественную опухоль от окружающей морфологически нормальной ткани молочной железы с чувствительностью 89,8% и специфичностью 100%. Использование этой системы для молекулярной классификации злокачественной опухоли и здоровой ткани молочной железы обеспечивает диагностическую чувствительностью 100% при 100%-ной специфичности.

Определено количество маркеров метилирования, необходимое и достаточное с точки зрения молекулярной классификации образцов клинического материала. В частности, в системе из 7 маркеров для постановки диагноза «рак молочной железы» достаточно выявления 4 маркеров в метилированном состоянии; наличие 2–3 маркеров характерно для прилежащей к опухоли морфологически нормальной ткани; в здоровой ткани молочной железы выявляется метилирование одного из маркеров системы. Указанные параметры позволяют проводить диагностику со специфичностью 100%.

^ Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработанная модификация метода амплификации интерметилированных сайтов является эффективным унифицированным инструментом скрининга дифференциального метилирования геномов, который может использоваться как для поиска, так и для характеристики новых маркеров метилирования при канцерогенезе.

2. Применение оригинального лабораторного протокола позволяет выявлять дифференциально и константно метилированные локусы генома в злокачественных опухолях, тканях, пограничных с опухолью, и аутопсийном материале молочной железы.

3. Определены достоверные связи ряда выявленных дифференциально метилированных локусов генома с клинико-морфологическими параметрами злокачественных опухолей молочной железы.

4. Существуют значительные различия в частотах аномального метилирования (информативности) маркеров в наборах, получаемых при использовании различных вариантов амплификации интерметилированных сайтов, в выборке образцов рака молочной железы. Наблюдаемые различия необходимо учитывать при формировании систем молекулярно-генетических маркеров для классификации образцов тканей молочной железы.

5. Характеристика частот метилирования геномных локусов позволяет сформировать системы диагностических маркеров, которые могут быть использованы для молекулярно-генетической классификации тканей молочной железы.

^ Апробация работы.

Материалы исследования были доложены на V конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (г. Москва) в 2008 г., конференции молодых ученых, посвященной 40-летию МГНЦ РАМН (г. Москва) в 2009 (диплом и премия), VI съезде Российского общества медицинских генетиков в 2010 г. (г. Ростов-на-Дону), III международной научно-практической конференции молодых ученых «Клинические и теоретические аспекты современной медицины» (г. Москва) в 2011 г., на конкурсе региональной программы "Умник" (г. Москва) в 2011г.

Разработанные в рамках исследования алгоритмы и компьютерные программы были использованы при выполнении НИР по гранту РФФИ № 08-04-01685 «Общие закономерности структурно-функциональной организации эпигеномов клеток рака молочной железы», по государственному контракту № 8/3-655н-08 от 31 декабря 2009 «Поиск и характеристика новых молекулярных маркеров для ранней диагностики, прогноза течения, мониторинга эффективности лечения рака мочевого пузыря», по государственному контракту № 8/3-657н-08 от 31 декабря 2009 «Поиск и характеристика новых молекулярных маркеров для ранней диагностики, прогноза течения, мониторинга эффективности лечения рака почки», по государственному контракту № 02.740.11.0089 от 15 июня 2009 в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы по теме «Разработка новых диагностических технологий на основе механизмов эпигенетической регуляции», по гранту Earlier Breast Cancer Test Foundation “Development and validation of a differential methylation screening technology applicable for the identification of early breast cancer diagnostic markers” (2007-2010 гг.).

^ Личный вклад автора.

Проведен анализ дифференциального метилирования ДНК в злокачественных опухолях, условно нормальных тканях, пограничных с опухолью, и аутопсийном материале молочной железы. Анализ включал в себя следующие этапы: экстракцию геномной ДНК, амплификацию интерметилированных сайтов и сравнение геномных профилей, планирование и осуществление рестриктазного картирования выявленных локусов. Все этапы исследования дифференциального метилирования ДНК выполнены лично. Проведен анализ полученных результатов: описание выявленных дифференциально метилированных локусов, оценка частот их метилирования, выявление корреляций дифференциального метилирования выявленных локусов с клинико-морфологическими характеристиками опухолей молочной железы. Разработаны системы маркеров метилирования для диагностики рака молочной железы, проведена оценка параметров чувствительности, специфичности и достаточности состава маркеров.

Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 25 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки для опубликования основных научных результатов диссертации, 17 тезисов, зарегистрировано 3 рекламно-технических описания компьютерных программ и 1 новая медицинская ДНК-технология.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 166 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы), описания результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 173 ссылки. Диссертация иллюстрирована 17 таблицами и 55 рисунками.

^ II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Материал для исследования. Образцы тканей рака молочной железы (РМЖ) были получены от 140 пациентов, прооперированных в ФГБУ «Медицинский радиологический научный центр» Минздравсоцразвития России и ФГУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт имени П.А. Герцена» Минздравсоцразвития России.

Гистологическую идентификацию тканей проводили в Клинико-морфологическом отделе ФГБУ «Медицинский радиологический научный центр» Минздравсоцразвития России и в Патологоанатомическом отделении ФГУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт имени П.А. Герцена» Минздравсоцразвития России. Гистологическую идентификацию тканей проводили по стандартной методике, степень дифференцировки опухолей оценивали согласно рекомендациям ВОЗ 1973 года. Все случаи РМЖ классифицированы по классификации TNM согласно требованиям Международного противоракового союза (UICC, версия 1989 г.) и Американского объединенного комитета по раку (AJCC, версия 2010 г.).

Клеточная линия РМЖ MCF7 предоставлена Федеральным государственным бюджетным учреждением науки «Институт биологии гена» Российской академии наук. Образцы крови нормальных доноров предоставлены донорским пунктом ГБОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова. ДНК клеточной линии РМЖ и нормальных мононуклеаров периферической крови использовали для валидации результатов применения разработанного модифицированного протокола амплификации интерметилированных сайтов.

Для получения ДНК необходимой степени чистоты геномную ДНК из лимфоцитов периферической крови и тканей выделяли стандартным методом (Sambrook et al., 1989).

^ Ферментативный гидролиз ДНК и лигирование с адаптерами.

Предварительную обработку ДНК проводили ферментами рестрикции -изошизомерами SmaI, XmaI (Сибэнзим, Россия), для дальнейшего лигирования ферментом T4 DNA Ligase (Fermentas, Литва) и амплификации.

^ Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили по стандартной схеме (Saiki, 1989) при помощи программируемого многоканального амплификатора ДНК «Терцик» фирмы ДНК-Технология с использованием термофильной ДНК-полимеразы Taq фирмы «ИнтерЛабсервис», г. Москва. В работе использована метилчувствительная ПЦР (МЧ-ПЦР). Принцип метода МЧ-ПЦР приведен в ранее опубликованных работах (Землякова и др., 2003).

Реакцию автоматического прямого секвенирования проводили на приборе ABI Prism 310, с использованием Genetic Analyzer Kits "Applied Biosystems" по протоколам производителя. Результаты секвенирования обрабатывали с использованием программы Chromas 3.01. Очистку продукта ПЦР для МС-секвенирования проводили согласно протоколу Quantum Prep Freeze ‘N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns (BIO-RAD, США).

Полимеразная цепная реакция для метода амплификации интерметилированных сайтов (АИМС).

ПЦР проводили по следующей схеме: к 0.1 мкг геномной ДНК добавляли 0.05 мкМ каждого олигопраймера, 200 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 1-2 ед. Taq-полимеразы, 2.5 мкл десятикратного буфера для ПЦР следующего состава: 50 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl (pH 8,4), 5 мМ MgCl2, 1.3 мкл формамида.

Фрагментный анализ продуктов АИМС.

Для визуализации результатов продуктов амплификации метода непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов проводили фрагментный анализ полученных проб, содержащих праймер с флуоресцентной меткой FAM. Фрагментный анализ проводили по протоколам ABI Prism 3100 Genetic Analyzer Kits (“Applied Biosystems”, США).

^ Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей проводили с использованием программ Blast и Fasta, Genebank Pustell, Genepro, WIN-SUN, Oligo 4.0, MethPrimer, Executor и Chromas. Дизайн эксперимента непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов осуществлен с помощью программы AIMS in silico; анализ электрофореграмм фрагментного анализа – с помощью программы PeakPick.


III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
^ 3.1. МОДИФИКАЦИЯ ИСХОДНОГО ПРОТОКОЛА МЕТОДА АМПЛИФИКАЦИИ ИНТЕРМЕТИЛИРОВАННЫХ САЙТОВ
Метод амплификации интерметилированных сайтов (АИМС) генерирует большое число фрагментов, отражающих профиль метилирования ДНК в клетке (Frigola J. et al., 2002). Модификации, введенные в оригинальный протокол формирования продуктов АИМС (рис.1), касаются этапов лигирования и амплификации продуктов рестрикции; протокол этапа рестриктазной обработки сохранен в виде, предложенном авторами метода.
^ Модификации метода АИМС на этапе лигирования
Процедура лигирования подразумевает ковалентные сшивки липких концов фрагментов, полученных в результате гидролиза ДНК рестриктазой XmaI (сайт узнавания C/CCGGG) с последовательностями двуцепочечных адаптеров путем денатурации их эквимолярной смеси при 65°C с последующим отжигом при комнатной температуре.




Рис. 1. Схема, изображающая поэтапное проведение метода амплификации интерметилированных сайтов (АИМС): рестриктазной обработки, лигирования и амплификации; m – метильная группа.

Адаптер имеет следующую структуру:


5’-ATTCGCAAAGCTCTGA-3’

||||||||||||||||

3’-TAAGCGTTTCGAGACTGGCC-5'


Одной из главных задач при разработке лабораторного протокола АИМС является создание таких условий реакции лигирования, при которых молекулы адаптера были бы полностью израсходованы. Такой результат обеспечивается минимизацией входной концентрации адаптеров.

Проведенный теоретический расчет реакции лигирования показал, что соотношение уровней полезного сигнала АИМС и шума равно соотношению входящих концентраций адаптеров и липких концов продуктов гидролиза ДНК. В настоящей работе входное количество ДНК составляет 1500 нг, что соответствует 30 нМ результирующих липких концов. Тогда для обеспечения соотношения «сигнал/шум», равного 100/1, входящая концентрация адаптеров должна составить 3000 нМ (3 мкМ). Для практического использования выбрана концентрация адаптеров 10 мкм, обеспечивающая превышение уровня сигнала над шумом примерно в 300 раз.

Титрование по входной концентрации адаптеров проведено для концентрации, предложенной авторами метода АИМС (100 мкΜ) и трех последовательных порядковых разведений (рис. 2). Критерий отбора оптимальной концентрации сформулировали следующим образом: наилучшее разрешение продуктов реакции при сохранении максимального числа фрагментов.

Как видно на рис. 2, в наибольшей степени этому критерию удовлетворяет реакция, проведенная при концентрации адаптеров, на порядок сниженной относительно оригинального протокола, что составляет 10 мкΜ и соответствует результатам проведенного теоретического расчета.





Рис. 2. Результаты титрования по входной концентрации адаптеров. Дорожки маркированы значениями кратностей порядковых разведений относительно оригинального протокола.
^ Модификации метода АИМС на этапе ПЦР
В исходном протоколе метода АИМС (Frigola J. et al., 2002) для проведения ПЦР использовано 3 пары праймеров с различными трех- и четырехнуклеотидными удлинителями, для каждой из которых были отработаны специфические условия амплификации:

Set A: Blue-CCGGG-^ CTA + Blue-CCGGG-TGG

Set B: Blue-CCGGG-CTG + Blue-CCGGG-TGG

Set C: Blue-CCGGG-CGCG + Blue-CCGGG-CAAC

(удлинители выделены полужирным шрифтом).

В работе, посвященной дизайну экспериментов и анализу результатов АИМС с использованием программы AIMS in silico (Танас А.С. с соавт., 2010) показано, что оптимальным для анализа метилирования промоторных CpG-островков является использование удлинителей CCG и GCG в раздельных реакциях. Для реакций АИМС с удлинителями CCG и GCG разработаны протоколы амплификации, параметры которых также определялись исходя из критерия получения наилучшего разрешения продуктов реакции при сохранении максимального числа фрагментов.
^ Модификации метода АИМС на этапах визуализации и геномной идентификации продуктов АИМС
В исходном протоколе для визуализации продуктов амплификации авторы использовали 6% денатурирующий полиакриламидный гель (ПААГ). Праймеры для ПЦР были снабжены радиоактивными метками. Поэтому после ПЦР проводилась радиоавтография геля.

Для идентификации продуктов реакции их вырезали и элюировали из геля. Затем авторы клонировали полученную ДНК в плазмидный вектор и секвенировали по стандартной методике Сэнгера. В разработанной модификации метода амплификация совокупности лигированных фрагментов проводится с флуоресцентно меченых праймеров. Флуоресцентная детекция спектра ПЦР-продуктов осуществляется с помощью фрагментного анализа на базе капиллярного электрофореза (рис. 3). Таким образом, методическая платформа исследования интегрирует метод АИМС и капиллярный электрофорез. Интеграция осуществляется при помощи специально разработанных для этого компьютерных программ AIMS in silico и PeakPick, анализирующих экспериментальные данные в контексте известных последовательностей генома человека.



Рис. 3. Пример визуализации флуоресцентно меченых продуктов АИМС, разделенных методом капиллярного электрофореза, с помощью специализированной программы PeakРick.

Традиционный дизайн АИМС с клонированием и секвенированием заменен последовательными этапами рестриктазного картирования in silico и in vitro.

При проведении такого рестриктазного картирования продукты АИМС обрабатываются ферментами рестрикции, индивидуально подбираемыми для каждого локуса с помощью программы AIMS in silico. Затем проводится сравнение электрофореграмм исходного продукта и того же продукта после обработки ферментом рестрикции (рис. 4).

Альтернативным методом, использованным для идентификации геномной принадлежности продуктов АИМС, является картирование по аналогии. Предполагаемый локус амплифицируется со специфических праймеров, причем область амплификации превышает исходные размеры искомого локуса, для того, чтобы в получаемый фрагмент полностью вошли сайты узнавания рестриктаз SmaI, XmaI. После амплификации и проверки на ПААГ локус проходит все этапы стандартной обработки АИМС и визуализируется при помощи капиллярного электрофореза. Наличие пика соответствующей формы на соответствующей длине определяется как идентифицированный локус.




Рис. 4. Пример рестриктазного картирования фрагментов АИМС-GCG, соответствующих участку промоторного CpG-островка гена DOCK6 (сигналы целевого фрагмента указаны стрелками; для картирования использована рестриктаза ApaI). Синяя линия соответствует электрофореграмме исходных продуктов АИМС, красная – электрофореграмме продуктов АИМС после гидролиза рестриктазой.
^ 3.2. ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТИЛИРОВАНИЯ НОРМАЛЬНЫХ И ОПУХОЛЕВЫХ ГЕНОМОВ МОДИФИЦИРОВАННЫМ МЕТОДОМ АИМС
Применение разработанной модификации метода АИМС к выборке операционных образцов рака молочной железы и нормальных тканей позволило идентифицировать облигатное метилирование CpG-островка гена CUX1 в составе альтернативного 3’-концевого экзона, интронных областей генов MAD1L1, TAF4 и 3'-CpG-островка гена ZBTB4.

В работе выявлено 19 аномально метилированных локусов. Частоты аномального метилирования этих локусов при РМЖ составляют от 5,1% до 87,4%. Причем частоты метилирования локусов панели GCG находятся в диапазоне от 34,5% до 87,4%, а панели CCG - в диапазоне от 5,1% до 59,7%.

^ Характеристика метилирования геномов модифицированным методом АИМС с удлинителем GCG
Анализ метилирования геномных локусов, соответствующих продуктам АИМС, проводится на основе сравнения электрофореграмм этих продуктов друг с другом и с полной репрезентацией (полным набором продуктов АИМС с конкретным удлинителем). Сравнения проводятся с использованием компьютерной программы PeakPick (рис. 5).




Рис. 5. Пример сравнения электрофореграмм полной репрезентации (синяя линия) и продуктов АИМС с удлинителем GCG для образца ДНК нормальной молочной железы (красная линия).

^ Характеристика константно метилированных участков геномов модифицированным методом АИМС с удлинителем GCG
Сравнение электрофореграмм полной репрезентации и продуктов АИМС для образцов ДНК нормальной молочной железы и РМЖ выявило среди продуктов АИМС с удлинителем GCG два константно метилированных фрагмента с длинами около 120 и около 150 п.н. (рис. 5). Рестриктазное картирование указанных областей показало, что эти фрагменты соответствуют интронному СpG-островку гена TAF4 (20q13.33) и участку интрона гена MAD1L1 (7p22.3). Фактические длины соответствующих продуктов АИМС составляют 124 и 156 п.н., соответственно. Пример рестриктазного картирования участка гена MAD1L1 приведен на рис. 6, 7.





Рис. 6. Рестриктазное картирование константно метилированного локуса MAD1L1 в режиме дизайна эксперимента AIMS in silico. Розовым на виртуальной электрофореграмме отмечен сигнал, соответствующий фрагменту ДНК, который содержит сайт узнавания рестриктазы ApaLI. Этот же сигнал соответствует фрагменту гена MAD1L1, получаемому при использовании АИМС с удлинителем GCG.




Рис. 7. Рестриктазное картирование константно метилированного локуса MAD1L1. Зеленым цветом показана полная репрезентация, красным – результат обработки образца ферментом рестрикции ApaLI. Картированный локус указан стрелкой.


Характеристика дифференциально метилированных участков геномов модифицированным методом АИМС с удлинителем GCG

Сравнение результатов АИМС с удлинителем GCG для образцов РМЖ позволило выявить дифференциальное метилирование 9 геномных локусов, положение некоторых из которых на электрофореграмме представлено на рис. 8. Среди них 7 локусов принадлежит определенным генам: LAMB1, RAI1, KCNH8, DOCK6, GPC2, SH3KBP1. Два локуса принадлежат межгенным областям: 1p33 и 5p15.33. Четыре из 6 внутригенных локусов принадлежали CpG-островкам промоторных областей генов LAMB1, DOCK6, SH3KBP1, KCNH8; один - CpG-островку гена GPC2 вне промотора. Локус, входящий в состав гена RAI1, не принадлежит CpG-островку. Локусы 1p33 и 5p15.33 соответствуют межгенным CpG-островкам (рис. 9).




Рис. 8. Пример выявления аномально метилированных CpG-островков 1р33, GPC2, RAI1, KCNH8, GPC2. Красный график – электрофореграмма продуктов АИМС-GCG, полученных с ДНК из образца РМЖ. Стрелками указаны сигналы продуктов аномально метилированных CpG-островков и константно метилированных генов TAF4 и MAD1L1. Ось абсцисс: длины продуктов АИМС в п.н.





Рис. 9. Схематичное изображение расположения локусов, полученных при использовании удлинителя праймера GCG, относительно кодирующих и регуляторных элементов генома.


^ Характеристика метилирования участков геномов модифицированным методом АИМС с удлинителем СCG Краткая характеристика константно метилированных фрагментов АИМС с удлинителем СCG
Сравнение электрофореграмм полной репрезентации и продуктов АИМС для образцов ДНК нормальной молочной железы и РМЖ выявило среди продуктов АИМС с удлинителем СCG два константно метилированных фрагмента с длинами около 130 и около 140 п.н. (рис. 10).




Рис. 10. Выявление константно метилированных локусов генома путем сравнения электрофореграмм полной репрезентации (синяя линия) и продуктов АИМС (красная линия) с удлинителем СCG для образца ДНК нормальной молочной железы.

Константно метилированные локусы картировали методом прямого секвенирования. Сопоставление полученных последовательностей (рис.11) с базой данных генома человека показало соответствие этих продуктов АИМС участкам CpG-островка альтернативного 3'-концевого экзона гена CUX1 и CpG-островка последнего экзона гена ZBTB4. Фактические длины соответствующих продуктов АИМС составляют 139 и 146 п.н., соответственно.




Рис. 11. Фрагменты последовательностей константно метилированных локусов, картированных методом прямого секвенирования: А - CUX1 (7q22.1), B - ZBTB4 (17p13.1).


Дифференциально метилированные фрагменты АИМС с удлинителем СCG

Сравнение результатов АИМС с удлинителем CCG для образцов РМЖ позволило выявить дифференциальное метилирование 11 локусов, положение некоторых из которых на электрофореграмме представлено на рис. 12.

Из них девять принадлежит двенадцати генам: ^ PPP2R5C, PHF15, ATMIN, C2CD2, KIAA1324L, IQSEC2, AX746725/AK127124, TMEM176A/TMEM176B, FOXM1/HKMT1188. Два локуса принадлежат межгенным CpG-островкам на хромосомах 12q13.13 и 13q32.1. Шесть генных локусов соответствуют CpG-островкам промоторных областей генов ^ PPP2R5C, PHF15, ATMIN, C2CD2, KIAA1324L, IQSEC2. Три локуса входят в состав CpG-островков, объединяющих промоторные области сразу двух генов: AX746725/AK127124, TMEM176A/TMEM176B, FOXM1/HKMT1188 (рис.13).




Рис. 12. Пример выявления аномально метилированных CpG-островков в системе АИМС-CCG. Оба графика – электрофореграммы продуктов, полученных с ДНК из образцов РМЖ. Стрелками указаны сигналы продуктов аномально метилированных CpG-островков и константно метилированного участка гена ZBTB4. Ось абсцисс: длины продуктов АИМС в п.н.



Рис. 13. Схематичное изображение расположения локусов, полученных при использовании удлинителя праймера CCG, относительно кодирующих и регуляторных элементов генома.


^ 3.3. Характеристика метилирования исследуемых локусов в норме и при РМЖ
С использованием модифицированного метода АИМС определены частоты метилирования 20 локусов в нормальных и опухолевых тканях (9 локусов из выборки АИМС-GCG и 11 локусов из выборки АИМС-CCG; табл. 1).

На сегодняшний день уже существует информация о состоянии метилирования некоторых локусов, исследуемых в настоящей работе, в небольшом количестве образцов нормальных мононуклеаров периферической крови, нормальной молочной железы и в клеточной линии рака молочной железы MCF7. Для подтверждения правильности определения состояния метилирования изучаемых локусов использовано сравнение с доступными базами данных (табл. 2).

Информация для валидации полученных результатов о метилировании CpG-островков в нормальной молочной железе, мононуклеарах периферической крови и клеточной линии РМЖ MCF7 получена из базы данных проекта ENCODE (The Encyclopedia of DNA Elements) при помощи программы просмотра элементов генома UCSC Genome Browser (University of California Santa Cruz). База данных содержит отчеты о статусе метилирования ДНК в составе более чем 500 тысяч CpG-динуклеотидов генома с помощью бисульфитного секвенирования ограниченных выборок (Meissner A. et al., 2008).

Информация о метилировании мононуклеаров крови получена также с помощью ресурсов базы данных NGSmethDB: A database for NGS single-cytosine-resolution DNA methylation data [http://bioinfo2.ugr.es/NGSmethDB/gbrowse/hg19/]. Исследователи сообщили об анализе 92,62% метилома мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) азиата, чей геном был расшифрован в рамках проекта YH - изучения МКПК анонимного китайского мужчины, условно именуемого Yan Huang (YH). Метилирование CpG-пар определялось с помощью полногеномного бисульфитного секвенирования с использованием геномного анализатора компании Illumina (Li et al., 2010).


Таблица 1. Частоты метилирования локусов АИМС-GCG и АИМС-CCG в образцах ткани РМЖ, прилежащей условно нормальной ткани и нормальной ткани молочной железы.


Локус

Опухоль, %

Условная норма, %

p

Нормальная молочная железа, %

LAMB1 (17q31.1)

16,1 (14/87)

9,1 (3/33)

н/д

0(0/4)

TAF4 (20q13.33)

100 (87/87)

87,9 (29/33)

<0,01

100 (4/4)

RAI1(17p11.2)

72,4 (63/87)

0 (0/33)

<0,01

0(0/4)

MAD1L1 (7p22.3)

100 (87/87)

100 (33/33)

н/д

100 (4/4)

KCNH8 (3p24.3)

80,8 (30/87)

12,1 (4/33)

<0,05

0(0/4)

DOCK6 (19p13.2)

34,5 (70/87)

3 (1/33)

<0,01

0(0/4)

GPC2 (7q22.1)

56,3 (49/87)

9 (3/33)

<0,01

0(0/4)

SH3KBP1 (Xp22.12)

64,4 (56/87)

54,5 (18/33)

н/д

0 (0/4)

1p33

79,3 (69/87)

17 (4/33)

<0,01

0(0/4)

5p15.33

87,4 (76/87)

39,4 (13/33)

<0,01

0(0/4)

PPP2R5C (14q32.31)

14,5 (9/62)

0 (0/34)

<0,01

0 (0/4)

PHF15 (5q31.1)

19,3 (12/62)

0 (0/34)

<0,01

0 (0/4)

ATMIN (16q23.2)

17,7 (11/62)

0 (0/34)

<0,01

0 (0/4)

C2CD2 (21q22.3)

6,5 (