Реферат: Вірусний гипатит С

--PAGE_BREAK--1.5 Лабораторна діагностика
При постановці діагнозу «гепатит С» необхідно враховувати наступні найбільш важливі фактори:
показники активності печінкових ферментів;
наявність чи відсутність маркерів інфікування вірусом гепатиту С (ВГС) і іншими гепатотропними вірусами;
дані епідеміологічного анамнезу;
результати клінічного обстежання пацієнта.
Тільки комплексний облік даних факторів дозволяє з високим ступенем надійності діагностувати це захворювання (Laverdant, 1989).
Це дає можливість:
виявити осіб з наявністю ВГС для зниження рівня посттрансфузіонного гепатиту С;
постановка діагнозу і розмежування гострого і хронічного гепатиту С;
прогноз захворювання;
призначення, оцінка і прогноз ефективності проведеної терапії;
вивчення широти поширення ВГС у популяції і різних групах населення.
Основою лабораторної діагностики гепатиту С є знання про ВГС, його реплікації, інформація про динамік появи і зникнення маркерів інфікування, а також сучасні імунохімічні і молекулярно-біологічні методи детекції антигенів, антитіл і нуклеїнових кислот. (Yuasa, 1991)
ВИЗНАЧЕННЯ АНТИ-ВГС. У 1989 році група дослідників фірми «Chіron Corporatіon» під керівництвом Q-L.Choo здійснила клонування РНК ВГС і одержала імунореактивні олігопептиди, що вступають у реакцію з антитілами, що циркулюють у крові хворих хронічним гепатитом «ні А, ні В». Ці олігопептиди стали основою діагностичних препаратів для виявлення антитіл до ВГС (Лакина, 2000)
КОНФОРМАЦІЙНІ ТЕСТИ. Для розмежування ложнопозитивних зразків і зразків, дійсно утримуючі антитіла до ВГС, розроблені додаткові (Supplemental) тести. Найбільше часто в цих тестах використовується принцип імуноблота, коли на нітроцеллюлозной мембрані адсорбуються у виді окремих смуг антигени, кодовані різними зонами РНК ВГС. Анти-ВГС взаємодіють з адсорбованими антигенами за допомогою мічених ферментом антитіл проти Іg людини з наступної їх детекціею за допомогою субстратного комплексу (Prince, 1996).
ВИЗНАЧЕННЯ Іg АНТИ- ВГС. В даний час створені і промислово випускаються діагностичні набори для виявлення Іg анти-ВГС На етапі конструювання діагностичних наборів були створені набори для ИФА, основою яких були пептиди, кодовані різними регіонами РНК ВГС. Вибір був зупинений на пептиді, кодованому Core регіоном РНК ВГС і виявленні антитіл до нього класу Іg (Исаева, 2001)
ВИЗНАЧЕННЯ АНТИГЕНІВ ВГС. Можливість визначення антигенів ВГС привертала увагу дослідників відразу ж після відкриття вірусу. Принципова можливість їхнього тестування була продемонстрована К. Krawczynskі зі співавторами, що імуногістохімічно знайшли в печіночній тканині антигени ВГС, довівши специфічність імунофлюоресцентного випромінювання. Застосування поли- і моноклональних антитіл до різних антигенів ВГС установило наявність ВГС core Ag, антигенів, кодованих NS3 і NS4 зонами РНК ВГС, у ядрі і цитоплазмі гепатоцитів, у 60-90% хворих хронічним ВГС.Однак подальші дослідження продемонстрували, що антигени ВГС удається знайти менш чим у 5% печіночних клітин (Букринская, 1996).
Установлені:
можливість визначення Core Ag ВГС у сироватці та плазмі крові;
специфічність виявлення Core Ag ВГС;
наявність осіб з циркулюючим антигеном у крові серонегативних по анти-ВГС;
часте (90,3%) виявлення Core Ag ВГС у сироватках крові з наявністю анти-ВГС і РНК ВГС;
пряма кореляція між концентрацією РНК ВГС і виявленням Core Ag ВГС;
Визначено, що Core Ag ВГС удається виявляти в 83% випадків (n=24) наступного дня після першого виявлення РНК ВГС і задовго (у середньому 26 днів) до появи анти-ВГС.
МЕТОДИ ВИЯВЛЕННЯ РНК ВГС. Сучасний етап лабораторної діагностики гепатиту С можна охарактеризувати як етап початку широкого застосування молекулярно — біологічних методів виявлення РНК ВГС. Переважна більшість методів виявлення нуклеїнових кислот було апробовано для виявлення РНК ВГС. Принципам конструювання діагностичних препаратів і їхньому застосуванню для детекції вірусних ДНК чи РНК присвячене значна кількість літературних оглядів, опублікованих як у вітчизняних, так і закордонних виданнях. Усі ці методи можна розділити на двох груп, в основі яких лежить застосування принципів гібридизації без ампліфікації обраної ділянки нуклеїнової кислоти та з їх ампліфікацією, що дозволяє значно підвищити здатність методу.
МЕТОД ГІБРИДИЗАЦІЇ заснований на з'єднанні мічених гібрідізаціонних зондів (генноінженерні чи синтетичні молекулярні структури, що містять у собі нуклеотидні послідовності, комплементарні обраним ділянкам РНК). Облік результатів здійснюють по інтенсивності сигналу, що надходить від мітки в складі комплексу, що утворився.
При гепатиті С цей метод виявлення РНК ВГС насамперед знайшов застосування для її ідентифікації безпосередньо в гепатоцитах, у тестах що позначаються — іn sіtu hіbіdіzatіon. Можливість безпосередньої детекції РНК ВГС у тканині дозволила знайти її в мононуклеарних клітках крові, клітках слинних залоз і інших тканин організму хворого гепатитом С (Моминалиев, 2000).
МЕТОД ГІБРІДІЗАЦІЇ, ЯКИЙ ЗАСТОСОВУВАЛИ ДЛЯ ДЕТЕКЦІЇ РНК ВГС, дозволяє продемонструвати наявність негативних (реплікативних) ланцюгів РНК ВГС, що свідчить про активну реплікацію вірусу.
Метод полімеразної ланцюгової реакції — у даний час найбільш широко застосовуваний методичний прийом, що лежить в основі практично всіх молекулярно-біологічних методів детекції РНК ВГС. Причому, визначення РНК ВГС можливе як у якісному, так і кількісному варіанті, що особливо важливо для призначення, моніторингу й оцінки ефективності застосовуваної терапії.
Як основні варіанти методу можна виділити:
полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР);
лігазну ланцюгову реакцію;
NASBA;
ТМА (Реакція транскрипційно-опосередкованої ампліфікації, Transcrіptіon-medіated amplіfіcatіon). У його основі лежить багатоцикловий процес, що нагадує природну реплікацію нуклеїнової кислоти, причому кожен цикл складається з послідовних етапів.
З досліджуваного матеріалу (сироватка, плазма крові, печінковий біоптат) виділяється РНК ВГС. З огляду на те, що нуклеїнова кислота ВГС представлена РНК, а для ампліфікації необхідна молекула кДНК, за допомогою ферменту — зворотної транскриптази, відбувається утворення одноланцюгових молекул кДНК ВГС. На наступному етапі до визначеної ділянки кожного з ланцюгів кДНК ВГС приєднуються т. з. праймери — короткі олігонуклеотиди, комплементарні відомим нуклеотидним послідовностям. Порівняння первинної структури 5'UTR області геному різних ізолятів ВГС виявило їхню незначну мінливість (між генотипами, гомологія нуклеотидів — 92-98%, а у середині генотипу 98-99%).
Далі, за допомогою ферменту ДНК-залежної ДНК полімерази відбувається синтез нових ділянок ДНК. В даний час як джерело цього ферменту найчастіше використовують бактерії Thermophіlus termus (Tth-полімераза) чи Thermophіlus aquatіcus (Taq-полімераза). Володіючи термостабільністю в присутності іонів марганцю і магнію, цей фермент може бути одночасно використаний для синтезу комплементарних одноланцюгових молекул кДНК ВГС і ампліфікації обраних ділянок кДНК. На завершальному етапі одного циклу реакції, за допомогою ДНК полімерази відбувається синтез нових ланцюгів комплементарних кДНК ВГС. Багаторазове повторення циклів реакції призводить до накопичення фрагментів кДНК ВГС, що можливо зареєструвати за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі з наступною візуальною детекцією чи із застосуванням гібридизації з олігонуклеотидними зондами, що збільшує чутливість і специфічність застосовуваних діагностичних препаратів. Застосування праймерів, мічених ферментами, дозволяє проводити облік результатів ПЛР за допомогою імуноферментного аналізу.
ЛІГАЗНА ЛАНЦЮГОВА РЕАКЦІЯ виявлення РНК BГ.(LCR).
Метод заснований на здатності ферменту «ДНК- залежної ДНК-лігази» зшивати (лігувати) розриви фосфодіефірного зв'язку в ДНК у присутності АТФ і іонів Mg2+. Так само як і при проведенні «класичної» ПЛР для виявлення РНК ВГС, перший етап LCR — зворотна транскрипція з одержанням кДНК ВГС. Далі ДНК-лігаза здійснює зв'язування двох пар праймерів (комплементарних 5' некодованій зоні РНК ВГС), що надалі ампліфікуються. Детекція продуктів ампліфікації LCR здійснюється за допомогою обліку реакції антитіло-антиген-антитіло. Кожний із двох праймерів мітиться різним гаптеном. Перший з них захоплюється антитілами, адсорбованими на мікрочастинках. Після процедури промивання за допомогою другої пари антитіл, мічених флуоресцентною міткою, відбувається їхня виборча взаємодія з гаптеном в ампліфікаційному продукті з наступним проведенням субстратної реакції й обліком на флюориметрі.
Чутливість цього методу складає близько 200 копій РНК ВГС у мл, що дозволяє його використовувати для рішення різних клініко-діагностичних задач.
NUCLEІC ACІDS SEAQUENCENCE AMPLІFІCATІON — NASBA — метод детекції РНК ВГС заснований на одночасній дії трьох ферментів: зворотної транскриптази вірусу мієлобластоми птахів, РНК-ази Н и РНК-полимерази Т7. На відміну від RT PCR на першому етапі не проводиться зворотна транскрипція РНК ВГС. За допомогою використаних ферментів вдається одержати більш 109 копій ділянки кДНК ВГС протягом 90 хвилин. Можливість проведення реакції при невеликих температурах (+41 С) значно спрощує роботу і дозволяє відмовитися від устаткування, що забезпечує циклічні зміни високих температур. Облік результатів реакції здійснюється за допомогою електрохемілюмінісценції. Незважаючи на те, що по своїй чутливості NASBA близька до RT PCR, метод широко не використовується для виявлення РНК ВГС. В даний час проводиться розробка варіанту методу, що сполучить принципи проведення NASBA і «Real-tіme RT PCR».
КІЛЬКІСНЕ ВИЯВЛЕННЯ РНК ВГС. Для оцінки концентрації РНК ВГС застосовують кількісний варіант ПЛР. Спочатку концентрацію РНК ВГС намагалися охарактеризувати порядковими величинами, наприклад "+","++" і т. д., що візуально відбивають інтенсивність смуг, отриманих при електрофорезі продуктів ампліфікації, чи ж методом кінцевих розведень, по наявності позитивного результату в кінцевій крапці титрування. Труднощі стандартизації всіх етапів ПЛР не дозволяють об'єктивно оцінити концентрацію РНК ВГС, що приводить до істотних помилок трактування отриманих результатів [Масалова, 2000].
В даний час результати дослідження виражають у кількісних одиницях: кількість копій РНК ВГС, що містяться в 1 мл, в абсолютному чи логарифмічному вираженні (log 10). Виходячи з того, що концентрація виявленої РНК ВГС відбиває кількість вірусних часток, даний показник позначають як «вірусний еквівалент (eq)», з додаванням приставки k (кілограм, тисяча) чи М (мільйон). Ще одним способом вираження кількості вірусних часток є їхні вагові еквіваленти. Комітет експертів ВООЗ по біологічній стандартизації виготовив «міжнародний стандартний зразок», що містить РНК ВГС (ліофільно висушена сироватка крові, що містить РНК ВГС 1-го генотипу), концентрація якої виражена в міжнародних одиницях (ІU/m).
Спеціальні коефіцієнти дозволяють перераховувати отримані показники концентрації в міжнародні одиниці.
Для визначення концентрації РНК ВГС застосовують практично усі варіанти ПЛР. При цьому до діагностичних препаратів пред'являється ряд специфічних вимог, найважливішим з який є лінійність результатів, тобто збільшення сигналу реєстрованої реакції при збільшенні концентрації РНК ВГС у досліджуваному зразку. Застосування внутрішніх стандартів з різним вмістом РНК ВГС дозволяє уникнути багатьох методичних помилок, що можуть відбитися на кінцевому результаті реакції.
ПЛР У РЕАЛЬНОМУ ЧАСІ («Real-tіme RT PCR») — один з найбільш перспективних варіантів кількісного методу виявлення РНК ВГС. Принцип методу полягає в здатності гідролізувати послідовності кДНК у напрямку 5'-і-і 3'. У реакції застосовується спеціальний зонд, мічений двома флуоресцентними барвниками, що мають близькі максимуми поглинання і флюоресценції. При наявності продуктів ампліфікації Tag-полімераза розщеплює зонд, що приводить до запобігання переносу енергії від однієї молекули барвника до інший, і тим самим запобігає вихіду кванта світла. Спеціальний прилад здійснює облік реакції і математичне моделювання кінетики флюоресценції на кожнім етапі реакції, що дозволяє одержати інформацію про вихідну концентрацію РНК ВГС.
Відмінною рисою «ПЛР у реальному часі» вважають можливість одержувати інформацію про наявність РНК ВГС безпосередньо в процесі реакції, що дозволяє зменшити час аналізу в сполученні з високою чутливістю і лінійністю одержуваних результатів. [Bukh, 2000].
МЕТОДИ ГЕНОТИПУВАННЯ РНК ВГС. Визначення приналежності ВГС до визначеного генотипу і субтипу знайшло своє застосування для рішення не тільки чисто наукових, але й практичних питань. Наприклад: пошук джерела інфекції під час спалахів гепатиту С чи прогнозування ефективності застосовуваної терапії.
«Золотий стандарт» генотипування ВГС — безпосереднє визначення первинної структури РНК ВГС із його наступним філіпченковим аналізом, що дозволяє чітко охарактеризувати даний ізолят вірусу [Kondo, 1993].
Незважаючи на точність одержуваного результату, метод безпосереднього секвенирування не використовується в практичній охороні здоров'я через технічні складності проведення дослідження і високої вартості робіт. Разом з тим наявність інформації про первинну структуру РНК ВГС є референтним методом генотипування, а наявність приладів для автоматичного секвенирування спрощує одержання результату. В даний час у більшості випадків для генотипування РНК ВГС застосовуються методи, засновані на використанні ПЛР із типоспецифічними праймерами. Гібридизація ампліфікованих продуктів із адсорбованими геноспецифічними зондами (з 5'-нетрансльованої зони РНК ВГС), адсорбованими на нітроцелюлозній мембрані.
Методичний арсенал визначення генотипів ВГС не обмежується перерахованими вище способами і містить у собі різноманітні методи:
генотипування на основі аналізу профілів рестрикції ампліфікованих продуктів. Продукти ампліфікації фрагментів РНК ВГС (NS5 область РНК ВГС) розщеплюються рестриктазами. Фрагменти, що утворилися, розрізняються по довжині в залежності від наявних усередині них сайтів рестрикції, по яких йде розщеплення. Результати електрофорезу і їхнє порівняння дозволяють ідентифікувати генотип ВГС у досліджуваному зразку. Порівняння результатів генотипування з даними секвенирування продемонструвало високий рівень збігу результатів — 95% [Ильина, 2000].
Генотипування на основі методу оцінки конформаційного поліморфізму одноланцюгових фрагментів ДНК. Як об'єкт дослідження обраний 5'-нетрансльований регіон РНК ВГС, що має мінімальний набір нуклеотидних варіацій, що відрізняють генотипи друг від друга. Цей факт визначає можливість застосувати загальні праймери при генотипуванні.
СЕРОТИПУВАННЯ Анти-ВГС стало можливим завдяки дослідженням P. Sіmmonds зі співавторами, який встановив наявність антитіл, спрямованих до генотипспецифічних епітопів, інформація про які кодована NS4 зоною РНК ВГС.
Серотипування анти- ВГС у порівнянні з генотипуванням РНК ВГС має такі переваги, як простота проведення реакції і більш низька вартість. Разом з тим, цей метод ні в якому разі не може замінити генотипування. Результати серотипування анти-ВГС свідчать про типову приналежність анти-ВГС при поточній чи раніше перенесеній інфекції. У деяких випадках (найбільше часто в хворих гемофілією) реєструється одночасне виявлення анти-ВГС різних підтипів, що може свідчити про множинне інфікування різними субтипами і генотипами ВГС. Крім того, у пацієнтів з гепатитом С на фоні вираженого імунодефіцитного стану РНК можуть бути єдиним маркером, що унеможливлює проведення серотипування [Мукомолов, 1999].
1.6 Лікування
До недавніх часів кращим засобом проти ВГС вважався інтерферон, ці ліки, що інгибують реплікацію вірусу. Медикаментозний інтерферон, що використовується для лікування гепатитів включає: ІNFγ-2b (інтрон-а), ІNFγ-2a (роферон-а) і ІNF alfacon-1 (інферген). Але інтерферони працюють тільки в 20% випадків [Саринсон, 1998]. Зараз ін'єкції інтерферону комбінують з пероральним введенням рибавірина (Виразол) — антивірусний агент широкого спектра дії. Лікування звичайно триває від 6 міс. до року, і є успішним приблизно лише для 40% хворих [Goodson, 1992].
Недавні дослідження показали, що інші ліки, пролонгований інтерферон, є в 2 рази більш ефективним, ніж звичайний інтерферон. У січні 2001 року Харчове і Лікарське Керування запропонували використання пролонгованого інтерферону — γ-2В — для лікування гепатиту С [Hoofnagle, 2001].
    продолжение
--PAGE_BREAK--Відомо, що функції інтерферону (ІFN) в організмі різноманітні, однак найбільш важливої з них є антивірусна, яка здійснюється шляхом стимуляції вироблення антивірусних білків у інтактних клітинах, що забезпечує в них розвиток т. н. антивірусного стану [Григорян, 1990]. Унікальні властивості ІFN з'явилися причиною активної розробки різних технологій його виробництва і клінічного застосування. Незважаючи на успіхи ІFN-терапии і розширення спектра його застосування, існує багато проблем, зв'язаних з цим видом лікування. Частота порушень ІFN статусу, розширення представлень про спектр захворювань, при яких необхідна терапія препаратами ІFN, висока вартість, можливість виникнення ряду ускладнень від їхнього застосування, стимулювали дослідження з вивчення індукторів ІFN.
Побічний ефект від застосування лікарської терапії інтерфероном містить у собі симптоми, схожі з грипом і тимчасове зниження вмісту гемоглобіну в крові (анемія), лейкоцитів і тромбоцитів у крові. Хронічні побічні ефекти — які складають приблизно половину при прийнятому лікуванні інтерфероном-рибавірином — включають сильну втому, занепокоєння, дратівливість і депресію. Невеликий відсоток людей випробує психологічні чи суїцидальні настрої. Вчені розробляють використання інгібіторів протеаз для лікування людей із ВГС. Ці ж медикаменти використовуються для деяких людей, хворих СНІДом. У майбутньому можливе лікування ВГС за допомогою генної терапії. Найкраще лікування для людей на кінцевій стадії печінкової хвороби (печінкова недостатність) є пересадження печінки [Подимова, 1998].
Встановлено, що в ряді випадків застосування індукторів ІFN має переваги перед використанням екзогенних ІFN. Так, індуктори ІFN стимулюють вироблення власних ІFN, що не володіють антигенностью. При цьому їхній синтез знаходиться під контролем ІЛ і білків-репресорів і не досягає рівня, здатного зробити дію, що ушкоджує, організм. Індуктори ІFN розрізняються по хімічній природі, по тому на які клітки-продуценти вони діють, синтез якого виду ІFN вони викликають, а також за часом досягнення максимальної концентрації ІFN у сироватці і тривалості дії препарату [Григорян, 1990].
Аміксин відноситься до класу флуоренів і є низькомолекулярним індуктором ендогенного інтерферону.
Амікcин поліпшує перебіг запального процесу, активує макрофаги, збільшує кількість протизапальних цитокінів, підвищує секрецію лізосомних ферментів, інгибує ферменти, субстратом яких служить ДНК: ДНК-полімераза, топоізомераза, зворотня транскриптаза. Про здатність аміксина брати участь у моделюванні імунної системи можна судити за результатами, що свідчать про активацію NK [Григорян, 1990].
У зв'язку з недостатністю інтерфероногенеза, що спостерігається в хворих вірусними гепатитами [Дидковский, 2000], у комплексному лікуванні гострих і хронічних вірусних гепатитів перспективним є застосування індукторів синтезу інтерферону [Івахів, 2001, Малий 2001]. Одним з індукторів синтезу інтерферону є циклоферон — низькомолекулярний індуктор інтерферону, що відноситься до класу акридонів.
Циклоферон є низькомолекулярним індуктором інтерферону, що визначає широкий спектр його біологічної активності (противірусної, імуномодулюючої, протизапальної, антипроліферативної, протипухлинної та ін.). Препарат індукує синтез раннього a-типу-інтерферону. У тканинах і органах, що містять лімфоїдні елементи, циклоферон індукує високий рівень інтерферону, що зберігається протягом 72 годин. Основними клітинами-продуцентами інтерферону після введення циклоферону є макрофаги, Т- і В-лімфоцити. У залежності від вихідного стану має місце активація тієї чи іншої ланки імунітету. Препарат індукує високі титри альфа-інтерферону в органах і тканинах, що містять лімфоїдні елементи (селезінка, печінка, легені), активує стовбурні клітини кісткового мозку, стимулюючи утворення гранулоцитів. Циклоферон активує Т-лімфоцити і природні кілерні клітини, нормалізує баланс між субпопуляціями Т-хелперів і Т-супресорів [Руденко, 2000, Романцев, 2000].
Циклоферон ефективний у відношенні вірусів кліщового енцефаліту, грипу, гепатиту, герпесу, цитомегаловірусу, вірусу імунодефіциту людини, вірусу папіломи й інших вірусів [Шостакович-Корецкая, 2000].
Імуномодулюючий ефект циклоферона виражається в корекції імунного статусу організму при імунодефіцитних станах різного походження й аутоімунних захворюваннях.
Застосування циклоферона при лікуванні гострого і хронічного вірусного гепатиту С сприяло більш швидкому поліпшенню самопочуття хворих, відновленню апетиту, зникненню жовтяниці. Клінічному поліпшенню відповідала позитивна динаміка біохімічних і імунологічних змін [Ершов, 1999, Солдогуб, 1999].
Аналізуючи данні наведені в огляді літератури слід зазначити, що на даний час використання імуномоделюючих препаратів, таких як аміксин і циклоферон є найбільш вдалим для лікування ВГС. Тому вивчення їх дії при лікуванні гепатиту С є доцільним.

2. Матеріали і методи
Нами проводилося дослідження лікувальної ефективності застосування імуномоделюючих препаратів у хворих на хронічний гепатит С. Дані отримували при вивченні клітинного, гуморального імунітету та біохімічних тестів у хворих, які знаходилися на стаціонарному лікуванні у НІІ очних хвороб і тканинної терапії ім… В.П. Філатова.
Матеріалом для дослідження була кров хворих на гепатит С.
2.1 Визначення показників клітинного імунітету
Визначення вмісту лімфоцитів і лейкоцитів у крові
Зважили пробу, отриману в результаті з'єднання 0,008 мл крові і 0,1 мл 10 % розчину оцтової кислоти в процесі забору крові, ретельно перемішали наконечником піпетки і заповнили нею камеру Горяєва. Підрахували кількість лімфоцитів і лейкоцитів (клітки крові чітко розрізнялися за формою ядра (у 20 великих квадрантах із застосуванням об'єктива х40).
Абсолютний вміст кліток а 1 мкл крові визначали по формулах:
Лей =К*а /1000
де Лей — вміст лейкоцитів у крові, тис/мкл
а — кількість лейкоцитів, у 20 великих квадрантах камери
Горяева.
Лі = К*б /1000
де Лі — вміст лімфоцитів у крові, тис/мкл
б — кількість лімфоцитів, у 20 великих квадрантах камери Горяєва.
К — коефіциєнт перерахунку: тут К= 169.
Визначення комплексу показників розеткоутворення і фагоцитозу
Приготування суспензії лейкоцитів
Лейкоцити, що містяться в суспензії, отриманої в результаті лізису еритроцитів у процесі забору крові, осадили центрифугуванням планшета при 200 д протягом 5 хв., надосадкову рідину злили із планшета. До отриманого осаду лейкоцитів долили 0,2 мл середовища 199, і одержали суспензію лейкоцитів, яку використали для постановки комплексу тестів розеткоутворення і фагоцитозу.
Постановка реакції розеткоутворення і фагоцитозу
Реакції розеткоутворення і фагоцитозу ставили у 96-лункових планшетах для імунологічних реакцій однократного застосування, що мали лунки обсягом 0,2 мл із круглим дном. Для герметизації в кришку планшета вкладали поліетиленову прокладку, яка вирізувалася з упакування планшета. Кришку закріплювали на планшеті за допомогою резинки.
Е- розеткоутворення (Т-лімфоцити)
У лунку планшета заливали 0,05 мл отриманої суспензії лейкоцитів. Доливали 0,05 мл 0,1 % суспензії еритроцитів барана. Центрифугували при 200 д протягом 5 хв., потім інкубували при +4°С протягом 30 хв.
М- розеткоутворення (В-лімфоцити)
Тест М- розеткоутворення ставили так само, як тест Е- розеткоутворення, але замість суспензії еритроцитів барана доливали 0,05 мл 0,1 % суспензії еритроцитів миші.
Д-фагоцитоз нейтрофілів
Тест Д-фагоцитоза нейтрофілів ставили також, як тест Е- розеткоутворення, але замість суспензії еритроцитів барана доливали 0,06 мл 0,1 % суспензії кліток пекараських дріжджів, вбитих нагріванням.
Е-розеткоутворення після інкубації кліток з теофіліном
(теофілін-резистентні Е- розеткоутворюючі лімфоцити — субпопуляція, збагачена клітками, що володіють хелперною активністю)
У лунку планшета заливали 0,05 мл отриманої суспензії кліток, доливали 0,05 мл 0,01 М розчину теофіліну в середовищі 199. Інкубували при 37 °С протягом 1 години. Далі доливали 0,05 мл 0,1 % суспензії еритроцитів барана і ставили реакцію Е- розеткоутворення.
Фіксація і приготування мазків
Після інкубації осаду при + 4 +10°С у лунки обережно, так щоб не зашкодити осад, додавали 0,02 мл фіксатора, приготовленого на основі глутарового альдегіду. Витримували при кімнатній температурі протягом 5 хвилин. Після цього надосадкову рідину видаляли одночасно з усіх лунок планшета швидким інтенсивним струшуванням. Потім у кожну лунку негайно додавали по 0,05 мл дистильованої води. Осад ресуспендировали у процесі готування мазків. Мазки готували на ацетатцелюлозній плівці у виді краплі, що займає квадрат розміром 9X9 мм. На поверхні прямокутної плівки розміром 90X130 мм міститься 96 мазків.
Можна використовувати флюорографічну плівку шириною 7 см, і мазки займали квадрати 8x8.
Приготування препаратів
Висушені мазки фіксували у метанолі протягом 10 хвилин (чи абсолютному етанолі протягом 20 хвилин). Потім поміщали у розчин метилового зеленого — піроніна. Через 30 хв. мазки виймали, змивали водою, промокали фільтрувальним папіром і сушать у розправленому стані між аркушами фільтрувального папера під вантажем. На висушену плівку наносять тонким шаром розчин канадського бальзаму в ксилолі і накривали ацетатцелюлозною плівкою такого ж розміру, яку щільно притискали. Отримана плівка з 96 препаратами готова до мікроскопії. При відсутності метилового зеленого — піроніна мазки можна фарбувати азуреозином при РН 5-6 протягом 10 хв.
Підрахунок кількості розеткоутворюючих і фагоцитуючих кліток
У препаратах перераховується число розеткоутворюючих лімфоцитів на 50 лімфоцитів і кількість фагоцитуючих нейтрофілів на 50 нейтрофілів із застосуванням об'єктива Х40, при правильному настроюванні світла в мікроскопі по Келлеру. Можна додатково прораховувати в цих препаратах кількість розеткоутворюючих нейтрофілів. За розеткоутворюючу клітку вважали таку клітку, до якої прикріпилося 3 і більша кількість еритроцитів. За фагоцитуючу вважати клітку-нейтрофіл, що захопив 1 чи більшу кількість дріжджових кліток. Обчислювали % розеткоутворюючих і фагоцитуючих кліток.
Визначення абсолютного вмісту розеткоутворюючих кліток у 1 мкл крові
Е-РУЛ тис/мкл = Лі тис/мкл * Е — РУЛ / 100%
М-РУЛ тис/мкл = Лі тис/мкл * М — РУЛ / 100%
де, Е-РУЛ — Е- розеткоутворюючі лімфоцити, відповідно тис/мкл, %;
М-РУЛ — М- розеткоутворюючі лімфоцити, відповідно тис/мкс, %;
Лі — вміст лімфоцитів у крові тис/мкл.
Визначення кількості теофілін-чутливих Е-РУЛ
ЕТФ-Ч-РУЛ = Е РУЛ — ЕТФ-Р-РУЛ
де, Е-РУЛ — кількість розеткоутворюючих лімфоцитів (спонтанних), %;
ЕТФ-Р-РУЛ — кількість теофілін-резистентних Е-РУЛ;
ЕТФ-Ч-РУЛ — кількість теофілін-чутливих Е-РУЛ, %.
Постановка комплексу тестів розеткоутворення і фагоцитозу
Лейкоцити, отримані в процесі забору крові, осаджували центрифугуванням планшетів. До отриманого осаду лейкоцитів доливали середовище 199, після чого суспензію кліток вносять у лунки чотирьох планшетів за допомогою крапельниць. Після цього в планшети вносять відповідні реактиви, і після постановки реакції готували мазки. Усі реактиви вносять у лунки планшетів за допомогою крапельниць. Мазки залишали до повного висихання. Висушені мазки фіксували у метанолі.
Визначення цитотоксичної активності НК-клітин
Отримували клітини мішеней.
Відмивали у среді і розводили до концентрації 106, 5*105, 105 кл/мл для співвідношення клітина-ефектор – клітина-мішень = 1:10, 1:50, 1:100 відповідно.
Постановка реакції:
Активність НК (цитотоксичність) вимірюють мікроскопічним методом. У пластикові камери з плоским дном, вносять 0,1 мл досліджуємих клітин, по 0,1 мл клітин мишей і культивують при 37оС у вологій камері з 5% СО2 протягом 4-16 годин. В контрольну лунку вносили клітини-мішені і використовували живільне середовище.
Оцінка реакції:
Після культивування підраховували кількість непошкоджених клітин у камері Горєва.
Індекс цитотоксичності визначали по формулі:
ІЦ=100%*а-в/а
Де а – кількість еритроцитів у середовищі без ефекторів,
в – кількість еритроцитів у середовищі з ефекторами
Приготування 10-кратного розчину Хенкса
На 1 л розчину беруть NaCl 80,0 г
КС1 4,0 г
MgS04*7H20 2,0 г
CaCI*6H2O 2,75 г
КН2Р04 0, 6 г
Na2HPO4*2H20 1, 53 г
Глюкоза 10, 0 г.
Розливали у невеликі щільно закриті ємності і зберігали у замороженому стані.
Приготування суспензії еритроцитів барана та мишей
Одержували від барана, перед постановкою реакції еритроцити відмивали у фізрозчині, осаджуючи щораз центрифугуванням при 400 g протягом 10 хв. доти, поки надосадкова рідина не стане безбарвною (звичайно 2 — 3 рази). Для готування суспензії 0,01 мл відмитого залишку еритроцитів змішували з 10 мл середовища 199. Суспензію зберігали при температурі + 4 +10°С не більш трьох годин, перед використанням збовтували.
Кров миші безпородної беруть у пробірку з гепарином, Відмивали і готували так само, як і суспензію еритроцитів барана. Збереження таке ж, як суспензії барана.
Суспензія клітин пекарських дріжджів
Ліофілізовані чи свіжі пекарські дріжджі розводять у фізрозчині (співвідношення 1:5 ) і витримували у киплячій водяній лазні протягом 60 хвилин. Зберігали при температурі О- 4°С до 12 місяців. Перед постановкою реакції дріжджі відмивали розчином Хенкса в тім же режимі, що й еритроцити доти, поки рН надосадкової рідини не буде 7,2-7,4 (тобто поки розчин буде зберігати свій колір). Суспензію кліток дріжджів готували і використовували так само, як суспензію еритроцитів.
2.2 Визначення показників гуморального імунітету
Визначення вмісту імуноглобулінів
Імуноглобуліни класів А, М, G — визначали у плазмі крові методом радіальної імунодифузії в гелі в модифікації методу Манчіні.
Одержання плазми
Планшет-штатив, що містить пластмасові трубочки зі зразками крові, центрифугували при 200° 10 хвилин. Верхню частину трубочки, що містить плазму, зрізували і переносять в інший аналогічний штатив у тім же порядку. Отриману плазму можна тривало зберігати в замороженому стані. Перед постановкою реакції плазму разморажували і переносять у лунки планшета, де розводять фізіологічним розчином у 3 рази (співвідношення плазма — фізрозчин 1:2).
Готування пластин, покритих шаром агару
На кришку 96-лункового планшета, що лежить на нагрівальній підставці (температура 50 °С) у строго горизонтальному положенні, наливали 16 мл розчину агару, що містить моноспецифічну сироватку до імуноглобулінів визначеного класу. Після охолодження на кришці виходить рівний шар гелю. У цьому шарі пробійником вирізували лунки діаметром 2 мм відповідно до розміру лунок стандартного 96-ямкового планшета. Таким чином, на пластині одержували 96 лунок.
Розчин агару, що містить моноспецифічну сироватку, готували таким чином: у першу чергу готували розчин, що містить 1,2 % агару, 2 % поліетиленгліколя (м. в. 6000) і 0,01 % мертіолата, інше — фізіологічний розчин. Нагрівали його до 50 °С при перемішуванні, після чого доливали антісироватку, щоб кінцева концентрація її в розчині відповідала зазначеної на ампулі.
Постановка реакції
У лунки першого ряду пластини, покритої шаром гелю, вносять стандартну сироватку нерозведену й у розведеннях 1:2, 1:4, 1:8 у такій кількості, щоб вона заповнила лунку до рівня агару (орієнтовно 3-4 мкл). Лунки інших рядів заповнювали зразками випробуваної плазми в розведенні 1:2. Далі пластини інкубували при 37 °С у вологій камері для визначення рівня ІgG протягом 4-6 годин, ІgA — протягом 12-24 годин, ІgM — 24- 28 годин. Інкубацію припиняли тоді, коли розміри кілець преципітації стандартних сироваток будуть достатні для упевненого виміру діаметрів. Для створення вологої камери зручно використовувати герметично закритий поліетиленовий пакет, на дно якого кладуть відпрацьований 96-луночний планшет, лунки якого наповнені водою.
Облік результатів
По закінченні інкубації на пластинах заміряли діаметри кілець, преципітації за допомогою окуляра-мікрометра в лупі МБС-9 з підсвітом через увігнуте дзеркало, у центрі якого знаходиться чорне коло, чим створюється ефект «темного поля», що різко збільшує контрастність краю преципітату в агарі.
Побудова калібровочної кривої і визначення змісту імуноглобулінів
Вміст імуноглобулінів у випробуваній плазмі визначали каліброваною кривою, яку будували на напівлогарифмічному папері таким чином: по осі абсцис відкладали діаметри кілець стандартної сироватки. По осі ординат — відома кількість імуноглобулінів, що містяться у відповідному образі стандартної сироватки, помножене на 3. Отримані крапки з'єднували. Таким способом будували калібровані криві окремо для кожного класу імуноглобулінів. Якщо по кожному класу тестується одночасно велика кількість зразків плазми (реально до 960) на одночасно приготовлених пластинах агару, то за умови стандартного часу, що витримується чітко, інкубації всіх пластин для даного класу імуноглобулінів калібрована крива залишається незмінної для усіх видів пластин.
    продолжение
--PAGE_BREAK--