Реферат: Анализ лекарственных веществ в биологических жидкостях

1. Связьпроблем фармацевтическойхимии с фармакокинетикойи фармакодинамикой

Кконцу 50-х — началу60-х гг. XX в. былообращено вниманиена зависимостьфармакологическойактивностиот таких физическихфакторов, какстепень измельченияи явлениеполиморфизма, а также оттехнологическихпроцессовполучения ЛС.Возникло своеобразноепротиворечиемежду существовавшиминормами оценкикачества ифактическимдействием ЛС.Последние порезультатаманалитическогоконтролясоответствовалив одинаковойстепени требованиямфармакопеи(ФС), но различалисьпо фармакологическомуэффекту. Таквозникло понятиео терапевтическойнеэквивалентностиЛС. Оно означает, что одни и теже ЛФ, содержащиеодинаковыеколичестваЛВ, но изготовленныеразными способами, оказываютнеодинаковыйтерапевтическийэффект. Установитьпричину такогоявления можнотолько проведениембиофармацевтическихи фармакокинетическихисследований.

Сформулированныек настоящемувремени основныепринципы установленияколичественныхсоотношениймежду химическойструктуройи фармакологическойактивностьюможно представитьв виде трехосновных стадий.Первая —биофармацевтическая— включаетисследованиеисходногобиологическиактивноговещества исоздание наего основеготовой лекарственнойформы. Втораястадия —фармакокинетическая— включаетисследованиетаких происходящихв организмекинетическихпроцессов, каквсасывание, распределение, связываниес белками, биотрансформацияи выведение(экскреция) ЛВ.Эти процессыизучаются всопоставлениис фармакологическимили токсическимдействием этихвеществ наорганизм. Третьястадия —фармакодинамическая— включаетисследованиевзаимодействияЛВ с рецептороми влияние нарегуляторныесистемы. Толькона этой стадиив полной мерепроявляетсяи являетсяспецифичнойвзаимосвязьхимическойструктуры ЛВи его фармакологическогоэффекта. Следовательно, биологическаяактивностьлекарств объясняетсяпоследовательнопроисходящимитремя фазами: биофармацевтической, фармакокинетическойи фармакодинамической.

Изучениемеханизмакачественныхи количественныхизменений ЛВв органах ибиологическихжидкостяхорганизмавходит в задачуфармакокинетики.На фармакокинетикуЛ В оказываютвлияние различныефакторы: возрастные, генетические, половые, массатела, питание, беременность, а также различныепатологическиепроцессы, напримерзаболеванияпечени, почек, сердечно-сосудистойсистемы, желудочно-кишечноготракта, эндокринные, инфекционныеи другие заболевания.

Проведениефармакокинетическихиспытанийосуществляетсяна стыке несколькихнаук и требуетучастия различныхспециалистов: врача-клинициста, врача-лаборанта, биохимика, провизора-аналитика, микробиолога, а в ряде болеесложных случаевтакже биофизика, математика, программиста.

Исследованияв областифармакокинетикипроводятсяна животныхв периодпредклиническихиспытаний, вовремя клиническихиспытаний, при разработкетехнологиипроизводстваи контролякачестваЛФ, а также продолжаютсяпосле внедренияЛС в медицинскуюпрактику.

Проведениефармакокинетическихисследованийвозможнотолько на основеприменениясовременныхметодовбиофармацевтическогоанализа, позволяющихпроследитьпроцесс всасыванияи распределенияЛВ в органахи тканях. Онивключают выяснениевлияния различныхбиофармацевтическихфакторов натерапевтическуюэффективностьЛ В; изучениеих биологическойдоступностии разработкуметодов ееопределения; создание способовопределенияЛВ и их метаболитовв биологическихжидкостях.Основнымфармакокинетическимпараметромявляетсяпродолжительностьдостиженияи сохранениемаксимальногоуровня концентрациилекарственноговещества вкрови, а такжескорость ихарактер ееснижения. Этообусловленоналичием корреляциимежду терапевтическимэффектом идлительностьюциркуляцииЛВ в плазмекрови.

Выполнениефармакокинетическихисследованийведет к накоплениюсведений околичественнойоценке рядакинетическихпараметрову людей. Так, например, имеютсямногочисленныеданные о связываниибольшинстваприменяемыхв медицине ЛВс белками плазмы, биодоступностипри приемевнутрь, выделениинеизмененногоЛВ с мочой (впроцентах кдозе), а такжео терапевтическихконцентрацияхв плазме крови(мкг/мл) и периодеполувыведенияиз плазмы крови(в часах) в норме, при почечнойи печеночнойнедостаточности, у людей различноговозраста.

Этиданныедают возможностьориентироватьсяв пониманиимеханизмадействия, прогнозированияхимическойструктурыЛВ, обусловливающейнаправленноедействие. Иначеговоря, результатыфармакокинетическихисследованийсущественнодополняютданные о связимежду химическойструктуройи фармакологическойактивностьюЛВ.

ЭффективностьвоздействияЛВ находитсяв зависимостиот путей еговведения ворганизм.

Процесспоступлениялекарственноговещества изместа введенияв кровь обозначаюттермином«всасывание».Этот процесспроисходитпри всех путяхвведения ЛС, за исключениемвнутривенногои внутриартериального.Всасываниезависитот пути введенияи растворимостиЛВ, а также откровотока вместе введения.При прохождениичерез слизистыеоболочкивсасываниеопределяетсярастворимостьюв липидах, рНсреды в желудкеи в кишечнике, ионизацией, активностьюихтранспорта, скоростьюабсорбции вразличныхотделах желудочно-кишечноготракта. ЗначительнымпревращениямподвергаютсяЛВ под влияниемферментовжелудочно-кишечноготракта и печени, вызывающихобразованиеразличныхметаболитов.На скоростьи полноту всасыванияЛВ оказываютвлияние моторикажелудочно-кишечноготракта, объемисостав пищи, интервал временимежду едой иприемом ЛС, воздействиепищи на секрециюжелудочногосока, объемжидкости, принимаемойвместе с ЛС.

Попавв системныйкровоток, ЛВраспределяетсяпо тканям организма.Этот процессносит названиераспределения.Он зависит отмножестваразличныхфакторов, наиболееважными изкоторых являютсярастворимостьв липидах, степеньсвязыванияс белками плазмыкрови, интенсивностькровотока.Растворимыев липидах ЛВбыстро распространяютсяпо всему организму.Многие ЛВ всилу большогофизико-химическогосродства кбелкам плазмыкрови (особеннок альбумину)связываютсяими (иногда на90%) и ограничиваютих концентрациюв тканях в местедействия.Образовавшиесякомплексы сбелком лишеныфармакологическойактивности.Наибольшаяинтенсивностьсистемногокровотоканаблюдаетсяв тех органахи тканях, которыеактивно перфузируютсякровью, — в сердце, печени, почках.ЗначительномедленнеенасыщаютсяЛВ мышцы, слизистыеоболочки, кожа, жировая ткань.Для достижениятерапевтическойконцентрациив этих тканяхнеобходимонередко несколькочасов. Важнымфактором, определяющимраспределениеЛВ, являетсятакже скоростьего диффузиив различныеткани.

Такимобразом, всасываниеи распределениелекарственноговещества зависятне только отпутей введения, но и от многихдругих факторов, обусловленныхкак физико-химическимисвойствамиЛ В, так и физиологическимипроцессами, происходящимив организме.

2.Фармакокинетическиепараметры

Количественнохарактеризуютпроцессы, происходящиес ЛВ в организме, основныефармакокинетическиепараметры, которые отражаютсвязь междуконцентрациейЛВ в биологическихжидкостях иего фармакологическимдействием.

Константаскорости всасывания— параметр, отражающийскорость поступления(ч, мин) ЛВ из меставведения всистемныйкровоток. Используютэтот параметрпри всех путяхвведения, кромевнутривенногои внутриартериального.

Константаскорости элиминации(ч, мин-1)характеризуетскорость удаления(элиминации)ЛВ из организмапутем экскрецииили биотрансформации.

Константаскорости экскрециихарактеризуетскорость выделенияЛВ (ч-1, мин-1)с мочой, слюной, калом, молокомили другимиэкскретами.

Важнымфактором, влияющимна терапевтическийэффект, являетсясодержаниеЛ В в организме.Оно зависитот продолжительностивыведения илиэлиминациииз организма.Показателемэлиминацииявляется клиренс(мл/мин). Общийклиренс — этообъем плазмыили крови, изкоторого заединицу времениЛВ выводитсяпочками, печенью, легкими илибиотрансформируетсяв организме.Параметр, определяющийскорость очищенияорганизма отлекарственноговещества почками, носит названиепочечный клиренс, а другими путями— внепочечныйклиренс. Клиренсв клиническойпрактике используютдля расчетатерапевтическойили поддерживающейдозы ЛВ в крови.

Объемраспределениялекарственноговещества — этогипотетическийобъем жидкостейорганизма, который необходимдля равномерногораспределениявсего количестваЛВ в той жеконцентрации, в которой онсодержитсяв плазме крови.Этот показательнаходится взависимостиот пола, возраста, общей массыжиров в организмебольного.РаспределениеЛВ зависит оттаких егофизико-химическихсвойств, какрастворимостьв воде и в липидах, молекулярнаямасса, полярность, уровень ионизации.Объем распределенияиспользуютдля расчетадозы ЛВ, необходимойдля достижениянужной концентрацииего в крови.

Овыведении ЛВиз организмасудят по периодупол у вы ведения, или полуэлиминации.Под ним понимаютвремя, в течениекоторого происходитснижение на50% концентрацииЛВ по сравнениюс введеннымколичеством.За один периодполуэлиминациииз организмавыводится 50%, за два периода— 75%, за три периода— 90% ЛВ.

Равновеснаяконцентрация— это состояние, при которомколичествавводимого иадсорбирующегосяЛВ равны междусобой. Поэтомупри равновеснойконцентрациисодержаниеЛВ в организмеколеблетсямежду максимальнымииминимальнымиего значениями.Это соответствуетоптимальномупроявлениюклиническогоэффекта.

Периодполуабсорбции(полувсасывания)— время (ч, мин), необходимоедля всасыванияЛВ из меставведения (кромевнутрисосудистого)в системныйкровоток половинывведенной дозы.

Периодполураспределения(ч, мин) — условныйпараметр, характеризующийраспределениеЛВ между центральнойкамерой (плазмакрови) и периферическойкамерой (органы, ткани).

Площадьпод фармакокинетическойкривой — площадьфигуры, ограниченнойна графикефармакокинетическойкривой и осямикоординат, однаиз которыхобозначаетконцентрациюЛВ в плазмекрови (мкг/мл), а другая — времяпосле введенияЛВ (мин).

2.1Основы фармакодинамики

Разнообразныеизменения, которые происходятв организмепод влияниемЛ В, называютсяфармакодинамикой.

Первичнаяфармакологическаяреакция сопровождаетсяпроцессомпереноса протонови электроновс одного веществана другое. Этоосуществляетсяза счет различныхтипов химическихсвязей. Наиболеечасто встречаетсяванн-дер-ваальсовтип связи. Такиесвязи возникаютмежду двумяфункциональнымигруппами, однаиз которыхвходит в составмолекулы ЛВ, а другая — вбиологическуюмолекулу.Ван-дер-ваальсовысвязи возникаютв тех случаях, когда молекулынаходятся наблизком расстояниидруг от друга, не превышающем0,2 нм, а энергиясвязи составляет0,836-4,18 кДж/моль.

Наиболееважное значениев действии ЛВимеют водородныесвязи (-ОН… О-) сэнергией-8,4-21кДж/моль. Водороднаясвязь появляетсятолько в томслучае, еслиатом, участвующийв ее образовании, располагаетсяна расстояниине более 0,3 нм.Атом водородаможет связыватьатомы серы, кислорода, азота, галогенов.

Междуионами, имеющимиразноименныезаряды, возникаютионные связи.Возможностидля их образованияв организмепрактическибезграничныввиду наличиябольшого количестваионов в биологическихсредах. Энергияионных связейсоставляет-21-42 кДж/моль, нодлительностьих существованияв организмеочень непродолжительнаи не превышает10~5с.

Немалуюроль в фармакологическихреакциях играетион-дипольнаясвязь, имеющаяэнергию порядка-8,4-21 кДж/моль. Такаясвязь ориентируетмолекулы ЛВотносительносоответствующейфункциональнойгруппы ферментаили рецептора.Возможны такжедиполь-дипольныесвязи, участвующиев фиксации ЛВна функциональнойгруппе рецептора.Их энергияравна -4,2-12,5 кДж/моль.

Наиболеепрочной являетсяковалентнаясвязь. Она образуетсямежду двумяатомами за счетобщей парыэлектронови имеет энергию42-627 кДж/моль.

Такимобразом, основойпервичноговзаимодействиямежду Л В и тканямиорганизмаявляется процесс, сопровождающийсяобразованиемван-дер-ваальсовых, водородных, ионных, дипольныхсвязей. Предполагается, что ЛВ притягиваетсярецептором, затем происходиториентацияего молекулыи, наконец, фиксациямолекулы нарецепторномполе. Следовательно, специфическийответ клеткиоргана илиорганизма вцелом происходитпосле адсорбцииЛВ на рецепторе.

Биофармацевтическиеи фармакокинетическиеисследованияпозволяютрешить рядпрактическихзадач, напримердать рекомендациипо изменениюфизическихили химическихсвойств Л В дляповышения ихфармакологическойактивности; обосноватьоптимальныйвыбор биофармацевтическихфакторов припроизводстветех или иныхЛФ. Практическоезначение имеюти такие рекомендации, как уточнениепоказаний ипротивопоказаний, установлениерациональныхтерапевтическихдоз и периодичностиих приема втечение суток, определениеоптимальныхпутей введенияЛС в организм, разработканаучно обоснованныхсхем лечениятех или иныхзаболеваний.

3. Понятиео биофармацевтическихфакторах

ЛСпредставляютсобой сложныехимическиесистемы, которыевступают вопределенныевзаимодействияс биологическимисистемамиорганизма. Наэтот процесссущественновлияют самыеразличныефакторы, известныепод названиембиофармацевтическихфакторов. Наиболеесущественнымииз них являютсяполиморфизм, степень дисперсности, физическиеи химическиесвойствавспомогательныхвеществ, используемыхпри изготовлениилекарственныхформ.

Фармакологическоедействиекристаллическихвеществ зависитот образованияполиморфныхформ. Полиморфизм— способностьвещества однойи той же химическойструктурыкристаллизоватьсяв различныхформах, т. е.изменять своюсингонию взависимостиот термодинамическихусловий. Однои то же веществопри соответствующихусловиях можетобразовыватьнесколькополиморфныхструктур, отличающихсядругот друга физическимиифизико-химическимисвойствами.Они могут отличатьсяпоплотности, удельнойтеплоемкости, проводимости, оптическими другим константам.Установитьналичие такихмодификацийможно по растворимости, температуреплавления, атакже с помощьюфизико-химическихметодов (ИК-, ЯМР-спектроскопия).

Степеньдисперсностиоказываетбольшоевлияние напроцесс всасыванияи терапевтическуюактивность.Как правило, последняявозрастаетеуменьшениемразмерадиспергированныхчастиц ЛВ. Уменьшениев 30 раз (по сравнениюс принятым ГФ)размера частицкислоты ацетилсалициловойусиливает вдвоеее действиена организм.Если подвергнутьочень тонкомуизмельчениюсульфаниламидныепрепараты, некоторыепрепаратыгормонов, тоадекватнаятерапевтическаяактивностьпри их применениидостигаетсявдвое меньшимидозами. В некоторыхслучаях, напримерпри применениипроизводныхнитрофурана, ЛВ следуетназначать ввиде крупныхкристаллов, чтобы уменьшитьраздражающеедействие наслизистыежелудочно-кишечноготракта.

Биофармацевтическиеисследованияочень важныдля оценки ролифизическихи химическихсвойств вспомогательныхвеществ, используемыхдля приготовленияЛФ. Вспомогательныевещества далеконе индифферентныв химическоми фармакологическомотношении. Онимогут снижатьфармакологическуюактивностьЛВ, повышатьее и даже изменятьхарактерфармакологическогодействия подвлиянием различныхфизическихи химическихпроцессов.

4.Способы установлениябиологическойдоступностилекарственныхсредств

Биологическаядоступность— это степеньвсасыванияJIBизместа введенияв системныйкровоток искорость, скоторой этотпроцесс происходит.Такое понятиепризнано ВОЗ.

Терапевтическийэффект зависитот того, какаячасть введенногоJIBпопадетв системныйкровоток изатем будетдоставленав те ткани илиорганы, в которыхосуществляетсяего специфическоедействие. Этотпоказательхарактеризуетбиологическуюдоступность.При внутривенномвведении онаравна 100%, при всехдругих способахприменения— всегда ниже100%. Это вызванотем, что, преждечем попастьв кровоток, JIBдолжнопройти целыйряд биологическихмембран клетокслизистойжелудка, печени, мышц и т.д.

Набиодоступностьоказываютвлияние биофармацевтическиефакторы, в частностилекарственнаяформа, пути еевведения, индивидуальныеособенностиорганизмачеловека, физиологическоеи патологическоесостояниежелудочно-кишечноготракта, сердечно-сосудистойсистемы, печени, почек и др.

Биодоступностьизучают путемсравнительногоисследованияизмененийконцентрацийJIBвплазме кровиили в моче послевведения испытуемойи стандартнойЛФ. Посколькувнутривенноевведение обеспечивает100%-ную биодоступность, можно установитьабсолютнуюбиодоступность, т.е. долю всосавшегосяв организм ЛВ, введенногоразличнымипутями, по отношениюк его количествупосле внутривенноговведения. Значительночаще определяютотносительнуюбиодоступность, которая отражаетсравнительнуюоценку всасыванияодного и тогоже ЛВ из испытуемойи стандартнойЛФ. Определениеведут по содержаниюЛВ в крови илив моче послеоднократногоили многоразовоговведения.

ТерапевтическаянеэквивалентностьЛВ (ЛФ), изготовленныхпо различнымтехнологиям(или различнымифирмами), зависитот различнойих биодоступности.В связи с этимсуществуетпонятие биоэквивалентностилекарственныхвеществ. Биоэквивалентностьустанавливаютпо таким тремпараметрам, как максимумконцентрацииЛВ в крови, времядостижениямаксимальнойконцентрациии площадь подкривой измененияконцентрацииЛВ в плазме илисывороткекрови, измереннаяво времени.Биоэквивалентныминазывают такиеЛВ, которыеобеспечиваютодинаковуюконцентрациюв крови и тканяхорганизма.Нередки случаи, когда аналогичныеЛВ биологическинеэквивалентны, так как имеютразличнуюбиодоступность.Поэтому приоценке биоэквивалентностиследует учитыватьважнейшиепараметрыбиодоступностиЛВ. Иными словами, оптимизациялекарственнойформы должнаосуществлятьсяс точки зренияобеспечениямаксимальновозможной дляданного ЛВстепени биодоступности.

БиологическуюдоступностьЛС можно установитьтремя различнымипутями: методамиinvitroспомощью приборов; методами invivoнаживотных илиу здоровыхлюдей-добровольцев.Установлениебиологическойдоступностиметодами invitroоснованона корреляционнойзависимостимежду скоростьювсасыванияи скоростьюрастворенияЛВ. Поэтому длярастворимыхвеществ методопределенияскорости растворенияслужит основнымметодом определенияэффективностивысвобожденияЛВ из ЛФ.

Принципдействия созданныхдля этогомногочисленныхприборов заключаетсяв механическомразрушенииЛФ и диффузииЛВ в воду илидругую растворяющуюсреду, имитирующуюбиологическуюжидкость. Помере высвобожденияили после полноговысвобожденияЛВ растворяющуюжидкость удаляютиз прибора.Полученныепробы подвергаютанализу, используяхимическиеили физико-химическиеметоды. Аналитическийконтроль —важнейший этаписпытания.Лекарственнаяформа признаетсясоответствующейтребованиямскоростивысвобождения, если в течениеустановленногоинтервалавремени из неепереходит врастворяющуюжидкость оптимальноеколичествоЛВ. Следуетотметить, чтоизучение кинетикивысвобождениялекарственноговещества invitroвмодельныхусловиях неможет заменитьисследованияinvivo.Вызваноэто различиемв механизмахпротекающихпроцессов. Так, при всасыванииinvivoвследза стадиейрастворенияЛВ следуетстадия проникновениячерез стенкижелудка и кишечника.В то же времяв условиях invitroмоделируетсялишь стадиярастворения.

Биологическаядоступностьметодами invivoустанавливаетсяна лабораторныхживотных (кроликах, собаках и др.).При этом либоопределяютсодержаниеЛВ (метаболитов)в крови, либоустанавливаютскорость ихвыведения смочой черезопределенныепромежуткивремени. Важнейшийэтап этих испытаний— количественныйанализ. Онусложняетсяпо сравнениюс методами invitro, посколькуприходитсяанализироватьсложную смесь, включающуюне только ЛВили их метаболиты, но и различныесоединения, входящие всостав биологическихжидкостей.

Дляхарактеристикибиодоступностишироко применяютспособ, основанныйна оценкемаксимальнойконцентрацииЛВ вкровипосле введениявнутрь изучаемойЛФ. Такой способявляется весьмаприблизительным, так как биодоступностьзависитне толькоот степени искорости всасывания, но и от распределенияи элиминацииЛВ в организме.

Дляопределениябиологическойдоступностиу здоровыхлюдей подбираютгруппы добровольцевопределенноговозраста исоответствующимобразом ихготовят: стандартизируютсядиета, количествовыпитой воды, физическаяактивность, исключаетсяприем другихлекарств, возможностьстрессовыхсостояний ит.д. Сущностьиспытанийзаключаетсяв установлениискорости выведенияЛВ с мочой черезопределенныепромежуткивремени послевведения ЛС.КонцентрациюЛВ или их метаболитовустанавливаютс помощью методикбиофармацевтическогоанализа.

Такимобразом, однимиз основныхэтапов любогоисследованиябиологическойдоступностиЛС являетсяиспользованиебиофармацевтическогоанализа дляопределенияконцентрацииЛВ (метаболита)в биологическихжидкостях.

5.Особенностибиофармацевтическогоанализа

Биофармацевтическийанализ — новоеперспективноенаправлениефармацевтическойхимии. Задачейбиофармацевтическогоанализа являетсяразработкаспособов выделения, очистки, идентификациии количественногоопределенияЛВ и их метаболитовв таких биологическихжидкостях, какмоча, слюна, кровь, плазмаили сывороткакрови и др. Толькона основе применениятаких методикможно выполнятьбиофармацевтическиеисследования, т.е. изучатьвопросы всасывания, транспортаи выведенияЛВ, его биологическуюдоступность, процессы метаболизма.Все это позволяетпредупреждатьвозможноетоксическоевоздействиеЛС, разрабатыватьоптимальныережимы фармакотерапиии контролироватьпроцесс лечения.Особенно важноопределятьв биологическихжидкостяхконцентрациюЛВ, когда онинаряду с терапевтическимэффектом проявляюттоксичность.Необходимотакже контролироватьсодержаниеЛВ в биологическихжидкостяхбольных, страдающихжелудочно-кишечнымизаболеваниямии заболеваниямипечени и почек.При такихзаболеванияхизменяютсяпроцессы всасывания, нарушаютсяметаболическиепроцессы, замедляетсявыведение ЛВиз организма.

Биологическиежидкости —очень сложныеобъекты длявыполненияанализа. Онипредставляютсобой многокомпонентныесмеси, включающиебольшое числонеорганическихи органическихсоединенийразличнойхимическойструктуры: микроэлементы, аминокислоты, полипептиды, белки, ферментыи др. Их концентрацияколеблетсяот 10 мг/мл донесколькихнанограммов.Даже в такойотносительнопростой физиологическойжидкости, какмоча, идентифицированонесколько сотенорганическихсоединений.Всякий биологическийобъект — оченьдинамичнаясистема. Еесостояние ихимическийсостав зависятот индивидуальныхособенностейорганизма, воздействияфакторов внешнейсреды (составпищи, физическаяи психическаянагрузка ит.д.). Все это ещев большей степениусложняетвыполнениебиофармацевтическогоанализа, таккак на фонестоль большогоколичествасложных похимическомустроению органическихвеществ нужноопределятьнередко оченьмалые концентрацииЛВ. Вводимыев биологическиежидкости ЛВв процессебиологическойтрансформацииобразуют метаболиты, количествокоторых нередкоисчисляетсянесколькимидесятками.Выделение этихвеществ изсложных смесей, разделениена индивидуальныекомпонентыи установлениехимическогосостава — задачанеобычайнотрудная.

Такимобразом, можновыделить следующиеособенностибиофармацевтическогоанализа:

Объекты исследования представляют собой многокомпонентные смеси соединений.

Количества определяемых веществ, как правило, исчисляются микрограммами и даже нанограммами.

Исследуемые ЛВ и их метаболиты находятся в среде, состоящей из большого числа природных соединений (белков, ферментов и др.).

Условия выделения, очистки и анализа исследуемых веществ зависят от вида биологической жидкости, подвергаемой

исследованию.

Помимотеоретическогозначения, котороеимеют исследованиявобластибиофармацевтическогоанализа дляизучениявновь создаваемыхЛВ, несомненнаи практическаяроль этой отраслизнаний.

Следовательно, биофармацевтическийанализ представляетсобой своеобразныйинструмент, необходимыйдля проведенияне толькобиофармацевтических, ноифармакокинетическихисследований.

6. Метаболизми его роль вмеханизмедействиялекарственныхвеществ

Метаболизму(биотрансформации)подвергаютсявсе вещества, в том числе илекарственные, независимоот путей введенияих в организм.Образовавшиесяпродукты превращенияназываютсяметаболитами.

Метаболизм—это комплекспроисходящихв организмефизико-химическихи биохимическихпроцессов, способствующихпревращениюв более полярныеводорастворимыекомпоненты, которые легчевыводятся изорганизма.ИзучениеметаболизмапозволяетустановитьмеханизмдействияЛВ, фармакологическуюактивностьили токсичностьметаболитов, скорость ихнакопленияили выведенияиз организмаидругиеявления биотрансформации.

Приняторазделятьлекарственныевещества насвойственныеорганизму ичужеродныеему. Свойственныеорганизмувещества, такиекак гормоны, витамины, аминокислоты, сахара, жирныекислоты, нуклеозиды, полинуклеотиды, метаболизируютсяспецифическимиферментнымисистемами, обеспечивающимифункцию организма.

Большинствосинтетическихорганическихи неорганическихсоединений, а также природныевеществарастительногопроисхожденияявляются чужероднымиорганизму. Ихназывают такжексенобиотиками.Они метаболизируютсяглавным образомв микросомахклеток с участиемразличныхнеспецифическихферментов(оксидаз, трансферази др.). Ксенобиотики, растворимыев липидах, медленнеевыводятся изорганизма имедленнееметаболизируются, а поэтомунакапливаютсяв нем. Металлы(ртуть, мышьяк, свинец, сереброи др.) образуютс белком прочнуюковалентнуюсвязьитакженакапливаютсяв организме.Ксенобиотики, принятые перорально, последовательнометаболизируютсявначале в слизистыхоболочкахжелудочно-кишечноготракта,азатем в печени, куда поступаютпосле всасывания.

Метаболитылекарственныхвеществ могутбыть фармакологическиактивными, атакже совершеннонеактивнымивфармакологическомотношении.

Болеевысокая активностьметаболитовпо сравнениюс их предшественниками— лекарственнымивеществами— обусловленатакими факторами, как превращениеболее полярноймолекулы вменее полярную(это приводитк увеличениюее липофильностии облегчениютранспортачерез биомембраны), усилениевнутрипеченочнойциркуляции, изменениескорости выведениявещества изорганизма, перераспределениеметаболитовмежду органамии тканями.

Значительнореже метаболизмприводит кобразованиютоксическихдля организмавеществ. Так, например, токсичностьметиловогоспирта обусловленапроисходящимв организмеокислениемего молекулыдо формальдегидаи муравьинойкислоты.

Такимобразом, в организмемогут происходитькак процессысинтеза, таки разрушения(деградации)молекул ЛВ. Присинтезе образуютсяболее сложныемолекулы новыхсоединений, менее токсичныедля организмаи более полярные, что улучшаетих растворимостьв воде и ускоряетвыведение изорганизма.Такой процессносит названиеконъюгации, а продуктысинтеза — конъюгатов.

ПроцесспревращенияЛВ в метаболитыпроисходитпо-разному.Одни практическиполностьюпревращаютсяв метаболиты, другие — толькона несколькопроцентов отвведенной дозы.Из одноголекарственноговещества можетобразоватьсянесколькометаболитов, иногда десятки.Образовавшиесяметаболитылибо выводятсяиз организма, либо подвергаютсядальнейшимпревращениям.

Всоответствиис современнымипредставлениямиметаболическиепроцессы условноделят на двефазы.Впервой фазев результатепроцессовокисления, восстановленияили гидролизаизменяетсямолекула ЛВс образованиемфункциональныхгрупп, имеющихактивные атомыводорода (оксигруппы, карбоксигруппа, первичные ивторичныеаминогруппыи др.). Во второйфазе происходитпроцесс конъюгацииобразовавшихсяфункциональныхгрупп с высокополярнымикислотнымиостаткамиглюкуроновой, серной кислот, некоторымиаминокислотамии др. В результатеэтого процессагидрофильностьмолекул метаболитоввозрастаетнастолько, чтоони легко выводятсяс мочой. Не всеЛВ метаболизируютсяпо указаннойдвухфазнойсистеме. Некоторыеиз них образуютконъюгаты, минуя первуюфазу, другиепосле первойфазы выводятсяпочками безпоследующейконъюгации.

НабиотрансформациюЛВ влияют пол, возраст, условияжизни, характерпитания,заболеванияит.д.Кромевлияния различныхзаболеваний, возможны такжеиндивидуальнаявариабельностькинетики метаболизма, индукция иугнетениеметаболизирующихферментов. Всеэто свидетельствуето том, что биотрансформацияЛВ являетсячрезвычайносложным процессом, зависящим отмногих экзогенныхи эндогенныхфакторов.

Исследованиемеханизмапроцессовметаболизма— проблема, которая входитв круг задачразличныхобластей химических, биологических, фармацевтическихнаук, в том числефармацевтическойхимии.

7. Сравнительнаяоценка методов, используемыхв биофармацевтическоманализе

Большоезначение имеетвыбор методапроведениябиофармацевтическогоанализа прифармакокинетическихисследованиях.Избранный методдолжен иметьвысокую чувствительность, возможностьработы с малымиобъемами проб, большую специфичностьи избирательность, отличатьсябыстротойвыполненияанализа, простотойподготовкианализируемыхпроб, несложностьюобслуживанияаналитическогоприбора, надежностьюи воспроизводимостьюметода, егоуниверсальностью(пригодностьюдля анализаразличных ЛВ), малой трудоемкостью, большойпроизводительность«)и возможностьюавтоматизациипроцесса анализа.

Избранныйдля этой целиметод долженбыть настолькочувствительным, чтобы он позволялдостовернои точно определятьв 10 раз меньшееколичество, чем среднееколичествовещества, всасывающеесяпосле приемаоднократнойдозы. Вместес тем методдолжен бытьдостаточноспецифичным, чтобы определятьнеизменившуюсячасть ЛВ вприсутствииего метаболитови эндогенныхсоединений.

Требованиям, предъявляемымк биофармацевтическомуанализу, отвечаюттолько чувствительныефизико-химическиеметоды.

Процессвыполнениябиофармацевтическогоанализа включаетнесколькопоследовательновыполняемыхстадий: экстракциюиз биологическойжидкости, разделение, идентификациюи количественноеопределениеЛВ или егометаболитов.

Передэкстракциейнеобходимоосадить белки(сульфатомаммония, растворомтрихлоруксуснойили хлорнойкислоты). Дляосаждениябелков используютобычно пробу, содержащуюоколо 0,2 мл сывороткикрови, к которойдобавляют 0,5мл 20%-ного растворатрихлоруксуснойкислоты ицентрифугируютпри 3000 об/мин втечение 20 мин.При этом достигаетсяполное осаждениесывороточныхбелков. Надосадочнуюжидкость декантируюти экстрагируютиз нее испытуемыевещества.

Процессыэкстракциианализируемыхлекарственныхвеществ и ихметаболитовиз биологическихобъектов осуществляютс помощью такихорганическихрастворителей, как диэтиловыйэфир, хлороформ, бензол, дихлорэтан, дихлорметан, я-гексан, изопропилхлорид, я-гептан, метиленхлорид, этилацетат, ацетон. Нередкосочетают вэкстрагентедва из указанныхрастворителей.Такой способназываютдвухфазнымэкстрагированием.Наилучшаяполнота разделениядостигается, если последовательноизвлекают избиологическойжидкости ЛВили его метаболитынесколькимирастворителями, например эфиром, этилацетатом, хлороформом, ацетоном, водой.Экстракциюпроводят вприсутствиикислот, щелочейили буферныхрастворов, создавая рНсреды, оптимальноедля извлеченияЛВ или егометаболита.

Вещества, содержащиесяв полученныхэкстрактах(реэкстрактах), определяютфотометрическим, спектрофотометрическимили флуориметрическимметодом.

Весьмаперспективенчувствительныйэкстракционно-фотометрическийметод, основанныйна экстракцииЛВ из биологическойжидкости споследующимвзаимодействиемс кислотнымиили основнымикрасителями(бромтимоло-вым синим, метиловыморанжевым, бромкрезоловымзеленым и др.).Образующиесяокрашенныепродукты (ионныеассоциаты)нередко специфичныдля ЛВ и количественноэкстрагируютсяорганическимрастворителем(хлороформом, бензолом, дихлорэтаном).

Наиболеечасто в биофармацевтическоманализеиспользуютспектрофотометриюв УФ- и видимойобластях спектра.Этот методотличаетсяпростотойвыполненияи достаточнойточностью, нетребует большогоколичестваопераций приподготовкек анализу испытуемогообразца. Сравнительноневысокаячувствительностьспектрофотометрическихметодик (от 1мкг/мл до 1 мг/мл)ограничиваетприменениеданного методадля тех группЛВ, суточнаядоза которыхсоставляетоколо 1 г.

Чувствительностьфлуориметрическогоанализа — около0,0! мкг/мл. По сравнениюс УФ-спектрофотометриейона выше в 10-100раз. Поэтомус помощьюфлуориметрическихметодик можноподвергатьбиофармацевтическомуанализу ЛВ, суточные дозыкоторых составляютнесколькомиллиграммов.Особенно высокойчувствительностьюотличаютсяспектрофлуориметрическиеопределения.Однако следуетучитывать, чтов биологическихжидкостяхорганизманередко содержатсявещества, обладающиефлуоресценцией.Флуоресцироватьмогут и метаболитыЛВ.

Тонкослойнаяхроматография(ТСХ) широкоприменяетсяв биофармацевтическоманализе ввидувысокой разрешающейспособностии чувствительности.Повысить разрешающуюспособностьТСХ можно, используяметод двумернойхроматографии.Метод ТСХ позволяетобнаруживатьдо 0,025 мг ЛВ. Выполнениеанализа занимаетот 30 мин до 2 ч. ТСХотличаетсяпростотойвыполнения, однако прианализе сложныхсмесей, содержащихбольшое числокомпонентов, этот метод невсегда позволяетдостигнутьнужного эффекта.Более перспективноиспользованиеТСХ в сочетаниис такими методами, как планиметрияи денситометрия.Биофармацевтическийанализ методомТСХ чаще всегосочетают сУФ-спектрофотометриейи флуоресцентнымметодом(хроматоспектрофотометрия, хроматофлуоресценция).

Оченьперспективноиспользованиев биофармацевтическоманализе масс-спектрометрии.Метод отличаетсявысокой разрешающейспособностью, в десятки разпревышающейдругие методы.Известны различныеварианты масс-спектрометрии.Один из нихоснован наприменениимасс-спектрометриис низкой энергиейионизирующихэлектроновпосле предварительноговыделенияфракции биологическойжидкости экстракциейили бумажнойхроматографией.

Газожидкостнаяхроматография(ГЖХ) ввиду высокойчувствительности, хорошей воспроизводимостииточности стоитна одном изпервых местсреди физико-химическихметодов, используемыхдля анализаЛВиихметаболитоввбиологическихжидкостях.Он позволяетопределитьмикрограммовыеи нанограммовыеколичестваэтихвеществ. Довыполненияанализа методомГЖХ необходимопредварительноосуществлятьмногократнуюэкстракцию(чаще эфиром, хлороформомили этилацетатом)иреэкстракциюЛВ или егометаболитов.

Очищенныйэкстрактконцентрируютиупариваютдосуха (еслинужно, в токесухого азота).Остаток подвергаютГЖХ анализуввыбранныхоптимальныхусловиях свнутреннимстандартоми использованиемгаза-носителя-азотапритемпературеиспарителя245°С, детектора305°С. Иногдаэкстрагируемыевеществапревращаютвначалев производные, азатем выполняютихГЖХ-анализ.Относительнаяпогрешностьметода ± (8-15)% присодержании10-25 нг/мл ЛВ вбиологическойпробе.

Высокоэффективнаяиливысокоскоростнаяжидкостнаяхроматография(ВЭЖХ) отличаетсяот ГЖХ тем, чтопозволяетиспытыватьсоединения, обладающиетермическойнеустойчивостьюи молекулярноймассой более400. Для этих соединенийисключаетсяфаза переводав летучиепроизводные.По сравнениюс ТСХ методВЭЖХ требуетменьших затратвремени навыполнениеанализа. Этообусловилоширокое внедрениеметода в практикубиофармацевтическогоанализа. В последниегоды созданысистемы дляВЭЖХ, позволяющиеиз 0,5 мл мочи водну стадиюбез предварительнойэкстракцииполучить до150 пиков индивидуальныхвеществ.

Особеннохорошие результатыв биофармацевтическоманализе былидостигнутыпри комбинированномприменениигазожидкостногохроматографаи масс-спектрометрав одном приборе(хромато-масс-спектрометрия).На основе такогосочетания былсоздан принципиальноновый методанализа трудноразделяемыхсмесей —масс-фрагментография.Суть методазаключаетсяв том, что масс-спектрометриспользуетсякак высокочувствительныйдетектор кгазовомухроматографу.Основное достоинствомасс-фрагментографии— чрезвычайнобольшая чувствительность, достигающаянесколькихпикограммов(1 пг= 10-12 г). Это в1000-10 000 раз выше, чемуГЖХ. Высокаяспецифичностьпозволяетанализироватьнеразделенныекомпонентыэтих смесей, а высокаячувствительностьдает возможностьопределятьметаболитыЛВ, применяемыхв очень малыхтерапевтическихдозах.

Большиевозможностив биофармацевтическоманализе открываетприменениерадиоактивныхизотопов. Впоследниеголысталиприменятьстабильныеизотопы, абсолютнобезвредныедля живогоорганизма вколичествах, необходимыхдля эксперимента.Стабильныеизотопы можнодолго хранить, так как они вотличие отрадиоактивныхизотопов нераспадаются.Радиохимическиеметоды отличаютсявысокой чувствительностьюи в сочетаниис хроматографиейдают возможностьвыявить всевещества срадиоактивнойметкой. Использованиемеченых молекулпозволяетустановитьраспределениеилокализациювведенногоJIBиметаболитовво всех системахорганизма сбольшой специфичностьюичувствительностью.В результатеможно получитьчеткое представлениео процессетранспортаи выведенияиз организмаэтих веществ.

Дляопределениямалых концентрацийЛВ и их метаболитовв биологическихжидкостях(крови, моче, тканях), а такжедля изученияметаболизмаи проведенияфармакокинетическихисследованийприменяютиммунохимическиеметоды. Ониоснованы навысокочувствительнойи специфичнойреакции антителс гаптенами(соответствующиминизкомолекулярнымибиологическиактивнымисоединениями)и на способностигаптена, содержащегоспециальновведеннуюметку, конкурироватьза активныйцентр антитела.