Лекция: Интерлейкин-1 выполняет также роль межклеточного сигнала, вовлекающего в процесс активации Т-лимфоциты и включающего механизмы специфического иммунного ответа.

Активированные Т-лимфоциты пополняют ресурсы воспалительных цитокинов, синтезируя гамма-интерферон, активирующий макрофаги. Существенную помощь фагоцитирующим клеткам в борьбе с бактериями оказывают продукты В-лимфоцитов – специфические антитела-иммуноглобулины.

В отличие от бактерий вирус является внутриклеточным паразитом, т.е. живет и размножается исключительно внутри клеток хозяина и за их счет. Поэтому существуют два пути: или атаковать и убивать зараженные вирусами клетки вместе с вирусами, или каким-то образом воспрепятствовать внутриклеточному размножению вирусов, если не удалось помешать их внедрению во входных воротах.

По первому пути идут разные типы цитотоксических клеток-киллеров, защищающие организм от вирусов. Распознав на поверхности зараженной клетки чужеродные антигены, клетки-киллеры впрыскивают в такую клетку-мишень содержимое своих цитоплазматических гранул, куда входит фактор некроза опухолей, протеолитические и липолитические ферменты и другие молекулы, повреждающие клетку-мишень. Результатом атаки киллера, как правило, является гибель клетки-мишени вместе с внутриклеточными паразитами.

Другой механизм защиты против вирусов – молекулярный. Ответственные за противовирусную защиту молекулы получили название «интерфероны», которое отражает их способность интерферировать, то есть противодействовать процессам биосинтеза вирусных частиц в клетке хозяина. Интерферон синтезируется клеткой-продуцентом в ответ на заражение вирусом. Клетка-продуцент выделяет (секретирует) молекулы интерферона, которые соединяются с соответствующими рецепторами на поверхности клеток, зараженных вирусом. Как в любом другом случае, взаимодействие цитокина (в данном случае интерферона) со своим специфическим рецептором влечет за собой передачу внутриклеточного сигнала к ядру клетки. В клетке включаются гены, ответственные за синтез белков и ферментов, препятствующих самовоспроизведению вируса в этой клетке. Таким образом, интерферон блокирует биосинтез вирусных частиц в зараженной клетке. Это позволяет использовать препараты интерферона в качестве лечебных при вирусных инфекциях.

Математическое моделирование иммунного ответа. Проблемам математического моделирования иммунных реакций посвящено большое число работ: только в русскоязычной части Интернета можно найти более 98000 ссылок на словосочетание «моделирование в иммунологии». В СССР одним из авторов этого направления математического моделирования в медицине являлся академик Г.И.Марчук. Он построил систему нелинейных дифференциальных уравнений, описывающих иммунные реакции человеческого организма на вирусные и бактериальные инфекции. В качестве примера можно назвать его книгу «Математические модели в иммунологии» [21], сборник работ под его редакцией «Математическое моделирование в иммунологии и медицине» [22]. Из работ других авторов – монографию Ю.М.Романовского, Н.В.Степановой и Д.С.Чернавского «Математическое моделирование в биофизике» [23], в которой этим проблемам отведена глава 9 «Динамика иммунной реакции», и ряд других.

Как правило, в моделях используются математический аппарат теории дифференциальных уравнений, а сама иммунная система рассматривается как аналог проточного культиватора (о моделях автоселекции микроорганизмов на протоке мы будем говорить в последней главе данной книги). Такая аналогия возможна потому, что специфичность системы антиген–антитело, как мы только что увидели, имеет ту же химическую основу, что и комплекс фермент–субстрат [24].

В качестве примера рассмотрим одну из простейших моделей [23, с. 181–185]. Пусть иммунокомпетентные клетки могут пребывать в трех разных состояниях:X,Y и Z. Здесь X – это концентрация клеток-предшественников, которые циркулируют в лимфатических узлах и погибают, если не встречают «свой» антиген, Y – концентрация быстроделящихся незрелых плазмоцитов, в которые перешли клетки X в результате взаимодействия с антигеном, Z – концентрация зрелых плазмоцитов, являющихся основными производителями специфических белков – антител. Переменные G и A характеризуют концентрацию антигена и антител соответственно. Тогда можно записать следующую замкнутую систему уравнений:

dX/dt = ν – kxX – αxXG, dY/dt = + μ(G)Y – αyYG + kyY ,

dZ/dt = – kzZ, где μ(G) = μ0G/(K + G), (1)

dG/dt =β0G – kgG – lg(GA)n, dA/dt =hyY + hzZ – kaA – la(GA)n.

Здесь αxXG – это скорость перехода клеток X в Y в результате взаимодействия с антигеном, член αyYG описываетпереход клеток Y в Z, член μ(G)Y – размножение клетокY. Величина β0G появляется в задачах инфекционного иммунитета, учитывая размножение бактерий и вирусов – носителей соответствующих антигенов. Константы kg и ka характеризуют время естественной гибели антигена и антител соответственно, hy и hz – скорости производства антител клетками Y и Z. Взаимодействие антител с антигенами описывается членами вида lg(GA)nи la(GA)n.

Рассмотренная модель позволяет охватить и периодические режимы, которые наблюдаются при колебательном течении некоторых заболеваний, например, при лихорадках. При определенной модификации модель может описать такие явления, как выздоровление организма или его гибель в результате заболевания. Компьютерные эксперименты показали ее хорошее согласование с экспериментальными данными.

Развиты и более сложные математические модели, которые учитывают реально существующее, как мы видели выше, взаимодействие иммунокомпетентных клеток, например, В- и Т-лимфоцитов [25]. Согласно указанной модели влияние кооперативного эффекта на интенсивность иммунного ответа наиболее существенно при малой численности популяций клеток, участвующих в распознавании антигена. Модель описывает случай, когда предварительно облученным мышам, у которых были убиты не только все лимфоциты, но и кроветворные клетки, одновременно с антигеном (эритроцитами барана) вводили различные количества лимфоцитов от животных той же линии. Для составления системы дифференциальных уравнений, описывающих эти опыты, были сделаны следующие допущения:

1) концентрация антигена достаточна, чтобы стимулировать все Т-лимфоциты данной специфичности;

2) взаимодействие Т-лимфоцитов и клеток­–предшественников В-лимфоцитов подчиняется законам бимолекулярных реакций;

3) после взаимодействия Т-лимфоцита с клеткой-предшественником последний переходит в пролиферирующее состояние, тогда как Т-клетка готова к новым взаимодействиям (т.е. не происходит ее инактивации);

4) число Т-лимфоцитов за время опыта остается постоянным;

5) антителообразующие клетки (В-лимфоциты) размножаются с постоянной скоростью и не успевают за время опыта перейти в терминальную стадию.

Построенная на основе этих допущений система уравнений имеет аналитическое решение. Его анализ показал, что, как и наблюдается в эксперименте, при малых значениях первоначального количества введенных лимфоцитов N0 < 2∙106 число антител к эритроцитам барана М в селезенке реципиентов растет пропорционально N02, тогда как при больших N0~2∙108 зависимость М(N0) становится линейной (подробнее см. монографию Ю.М.Романовского, Н.В.Степановой и Д.С.Чернавского «Математическая биофизика» [26], с. 107–108).

Отдельного обсуждения за рамками данной главы заслуживает моделирование специфического иммунитета в связи с проблемой рака. Этой теме посвящена глава 6 монографии [26, с. 107–108] и ряд других работ.

Функциональная характеристика индуцибельной изоформы синтазы монооксида азота.Оксид азота NO (или окись азота) был открыт в 1774 г. английским исследователем Джозефом Пристли (1733–1804), который впервые выполнил реакцию

(2)

а ее газообразный продукт назвал селитряным воздухом. Оксид азота – важный фактор, определяющий состояние окружающей нас атмосферы и внешние условия существования. Однако это же вещество, как оказалось, является и мощным внутренним биорегулятором. Оксид азота образуется в результате окисления аминокислоты аргинина с одновременным синтезом другой аминокислоты цитруллина под влиянием фермента NO-синтазы (NOS) [27]. Фермент был назван синтазой, а не синтетазой, поскольку для его работы не требуется энергия АТФ.

(3)

Общая продукция окиси азота в организме превышает 100 мг в сутки. Период полураспада NO или ее комплексов в организме колеблется от 1 до 6 с, что достаточно для диффузии через внутриклеточную среду, клеточные мембраны и внеклеточную среду.

NO-синтаза – это сложно устроенный фермент, представляющий собой гомодимер, то есть он состоит из двух одинаковых белковых субъединиц, к каждой из которых присоединено несколько кофакторов, определяющих каталитические свойства фермента (рис. 6.5). Активность фермента проявляется только при объединении двух его субъединиц.

Одним из важных кофакторов является внутриклеточный кальцийсвязывающий белок кальмодулин. При повышении содержания ионов кальция в клетке он присоединяется к молекуле NO-синтазы, что приводит к активации фермента и синтезу NO. Такое свойство фермента имеет большое значение для клеток, поскольку ферментативная активность, а значит, и синтез NO прямо зависят от функционального состояния клетки, определяющегося во многом внутриклеточным уровнем ионов кальция – высокоактивных посредников, влияющих на многие процессы в клетках. Среди других регуляторных механизмов фермента следует отметить возможность фосфорилирования белковой части молекулы и влияние особых белков, участвующих в связывании двух субъединиц фермента в единый функционально активный комплекс.

NO-синтазы составляют семейство, то есть имеется группа ферментов, несколько различающихся по аминокислотной последовательности белковой части молекулы и механизмам, регулирующим их активность, но тем не менее катализирующих одну и ту же реакцию превращения аминокислот с образованием оксида азота. Две изоформы, которые постоянно присутствуют в клетках (так называемые конститутивные формы), были получены из эндотелиальных клеток сосудов (еNOS) и нервной ткани (nNOS). Третья изоформа, выделенная из активированных макрофагов, синтезируется под действием цитокинов и других биологически активных веществ, появляющихся в организме при патологиях, требующих вмешательства иммунной системы. Эта изоформа обозначается как индуцибельная NOS (iNOS).

Рис. 6.6. Схематическое представление строения NО-синтазы [28]. Фермент является димером, состоя­щим из двух одинаковых белковых молекул, каждая из которых связана с необходимыми для работы фермента кофакторами: НАДФН – восстановленная форма никотинамидадениндинуклеотидфосфата, ФАД –флавинадениндинуклеотид, ФМН – флавинмононуклеотид, гемовая группа, содержащая железо (Fe), кальмодулин (СаМ) и тетрагидробиоптерин (ВН4). Связь между белковыми субъединицами происходит в области их N-конца, где с ними свя­заны гемовые группы. Стрелками показан перенос электронов.

Индуцибельные изоформы NO-синтазы проявляют активность через некоторое время (как правило, 6-8 ч – время, необходимое для активации генов и начала синтеза фермента) после внешнего воздействия на клетки, продуцируют огромные (в 100-1000 раз больше, чем конститутивные изоформы фермента) количества NO. Поскольку высокие дозы NO токсичны для клеток, эта форма фермента считается патологической в отличие от конститутивной.

В нормальных условиях клетки не содержат этот фермент и не продуцируют NO. Под влиянием липополисахаридов микробного происхождения или цитокинов в макрофагах начинается синтез индуцибельной изоформы NO-синтазы, образующей большой объем NO, оказывающего, в свою очередь, цитостатическое и цитолитическое действие на бактериальные и чужеродные, в том числе и раковые, клетки.

Значение NO в кровообращении многогранно. Прежде всего NO – мощный сосудорасширяющий агент. Расширение сосудов связано с диффузией NO из эндотелия к соседним гладкомышечным клеткам стенки сосуда, активацией в них гуанилатциклазы и образованием циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ). Повышение уровня цГМФ приводит к снижению уровня ионов кальция в цитозоле клеток и ослаблению связи между миозином и актином. Это позволяет клеткам расслабляться, т.е. принимать первоначальную форму и размеры.

Большое значение NO имеет в регуляции мозгового кровообращения. Имеется несколько источников NO для регуляции просвета мозговых сосудов. Это эндотелий сосудов, нейроны, содержащие NO-синтазу и оплетающие своими отростками стенки сосудов и астроциты, образующие периваскулярные оболочки (рис. 6.7).

Рис. 6.7. Участие NO в регуляции тонуса кровеносных сосудов в головном мозге [28]. Источниками NO могут являться эндотелий кровеносных сосудов, астроциты, клетки микроглии, периваскулярные нервные волокна, происходящие из внечерепных ганглиев, и расположенные около сосудов нейроны, содержа­щие NО-синтазу. Синтез NO в отростках этих нейро­нов может активироваться при воздействии на них глутамата (Гл)

В нервной системе NO имеет большое значение как в нормальных физиологических условиях, так и при различной патологии. Источниками NO в центральной нервной системе (ЦНС) являются нейроны, нейроглиальные клетки – астроциты и клетки микроглии (достоверные данные о наличие NO-синтазы в других нейроглиальных клетках – олигодендроцитах и эпендимных отсутствуют) и эндотелий кровеносных сосудов.

Нейроны, содержащие NO-синтазу, находятся во многих отделах ЦНС и большинстве изученных периферических ганглиев нервной системы. В коре больших полушарий в среднем 2% процента нейронов содержат NO-синтазу, в большинстве других отделов головного мозга число таких нейронов также невелико. Однако имеются и области с высоким их содержанием.

Так, максимальное количество нейронов, содержащих NO-синтазу, находится в коре мозжечка, где большинство клеток-зерен и корзинчатых нейронов содержат фермент. Самые крупные нейроны коры мозжечка – клетки Пуркинье не содержат NO-синтазу. Сравнительно много нейронов, содержащих NO-синтазу, находится в обонятельных луковицах, а также в некоторых отделах гиппокампа и полосатого тела. Только, по-видимому, в мозжечке нейроны, содержащие NO-синтазу, составляют компактную популяцию клеток, в остальных отделах это одиночные, редко расположенные нейроны.

Значение NO в ЦНС в нормальных условиях связывают с тремя процессами (так называемая NO-гипотеза):

Участие в межнейронной связи в качестве своеобразного нейромедиатора, причем основное значение, как полагают, NO имеет в синаптической пластичности, под которой понимают эффективность синаптической передачи,