Лекция: Биотехнология, генная инженерия и биобезопасность

Понятие о биотехнологии. Существуют несколько трактовок термина биотехнология [43]. Часто под биотехнологией понимается наука, изучающая возможности использования организмов, биологических процессов и систем в производстве, включая превращение различных видов сырья в высококачественные продукты. Ее основой являются генетическая и клеточная инженерия в сочетании с микробиологическим синтезом и широким набором методов биохимии, биоорганической химии и биопроцессорной инженерии. Кроме того, биотехнология трактуется как совокупность промышленных методов, использующих для производства живые организмы и биологические процессы, например в хлебопечении, виноделии, производстве медпрепаратов (эндокринных и т.п.), биологической очистке сточных вод и т.д.

Впервые термин «биотехнология» применил венгерский инженер Карл Эреки в 1917 г. Однако отдельные элементы биотехнологии появились достаточно давно. Фактически, это были попытки использовать в промышленном производстве отдельные клетки (микроорганизмы) и некоторые ферменты, способствующие протеканию ряда химических процессов. Современную биотехнологическую промышленность иногда разделяют на четыре направления:

· «Красная» биотехнология – производство биофармацевтических препаратов (протеинов, ферментов, антител) для человека, а также коррекция генетического кода.

· «Зеленая» биотехнология – разработка и внедрение в культуру генетически модифицированных растений.

· «Белая» биотехнология – производство биотоплива, ферментов и биоматериалов для различных отраслей промышленности.

· «Академическая и правительственная» биотехнология – например, расшифровка генома риса.

Для ознакомления с основными направлениями и методами биотехнологии сельскохозяйственных растений рекомендуем учебник Н.А.Картеля и А.В.Кильчевского «Биотехнология в растениеводстве» [44].

Микробиологическая индустрия России, относящаяся к «красному и «белому» направлениям биотехнологии, выпускает 150 видов продукции, ее гордость – кормовой белок, получаемый на основе выращивания дрожжей. В год его производят более 1 млн. т. Другое важное достижение – это выпуск ценнейшей кормовой добавки – незаменимой аминокислоты лизина. Усвояемость белковых веществ, содержащихся в продукции микробиологического синтеза, такова, что 1 т кормового белка экономит 5–8 т зерна. Добавка 1 т биомассы дрожжей в рацион птиц, например, позволяет получить дополнительно 1,5–2 т мяса или 25–35 тыс. яиц, а в свиноводстве – высвободить 5–7 т фуражного зерна. Кормовой белок может быть получен также и путем выращивания микроскопических зеленых водорослей, различных простейших и других микроорганизмов. В России уже разработаны технологии их использования, проектируются и строятся предприятия-гиганты мощностью от 50 до 300 тыс. т продукции в год.

Особенно интенсивно биотехнология стала развиваться с 1981 г. в связи с открытием методов рекомбинантных РНК и ДНК и прогрессом генной инженерии. Стремительно расширяющиеся знания о процессах жизнедеятельности позволяют не только приспосабливать эти процессы и управлять ими, но также создавать весьма перспективные в практическом плане новые системы, до того не существовавшие в природе.

Биотехнология и генная инженерия. Основой современной биотехнологии является генная, или генетическая инженерия – совокупность приемов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы, имеющая своим результатом создание генетически модифицированных организмов (ГМО). Рекомбинантная ДНК – это искусственно созданная человеком последовательность ДНК, части которой синтезируются химическим путем, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или клонированы из ДНК различных организмов. Эти рекомбинантные ДНК встраивают в состав бактериальных плазмид или вирусных векторов, которыми затем трансформируют клетки живых организмов (микроорганизмов, растений, животных). Генетически модифицированные животные и растения обычно содержат рекомбинантные гены, встроенные непосредственно в их хромосомы.

Генная инженерия микроорганизмов. Методом генной инженерии уже получен ряд препаратов медицинского назначения, в том числе инсулин человека и противовирусный препарат интерферон. В основе этих достижений лежит создание рекомбинантных плазмид, несущих соответствующие целевые гены. Поскольку плазмидная ДНК представляет собой замкнутую кольцевую молекулу, кольцо сначала разрывают, чтобы свободные концы были в химическом отношении реакционноспособными. Это достигается с помощью различных ферментов, называемых нуклеазами (рестриктазами). Затем фрагменты ДНК соединяют с помощью лигаз – ферментов, исправляющих повреждения в ДНК и сшивающих концы ее разорванных нитей. Именно таким путем на заре генной инженерии плазмиды из штамма E. coli, устойчивого к тетрациклину, и плазмиды из штамма, устойчивого к другому антибиотику, каномицину, были соединены и получили штамм E. coli, устойчивый к обоим антибиотикам.

После переноса плазмид с нужными генами в микроорганизмы последние становятся биореакторами по производству ряда соответствующих веществ. Их производство составило важную отрасль биотехнологии. В частности, начиная с 1982 г. фирмы США, Японии, Великобритании и других стран производят генно-инженерный инсулин для лечения диабета. Из 1000 литров бактериальной культуры получают приблизительно 200 г инсулина, что равно количеству, получаемому из 1600 кг поджелудочной железы животных [45].

Интерферон – белок, синтезируемый организмом в ответ на вирусную инфекцию, изучают сейчас как возможное средство лечения рака и СПИДа. Всего 1 л бактериальной культуры дает такое количество интерферона, для получения которого потребовалось бы ~10 тыс. л крови человека. Методами генной инженерии удалось создать также ряд вакцин, которые испытываются для проверки их эффективности против вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). С помощью рекомбинантной ДНК получают в достаточных количествах и человеческий гормон роста, являющийся единственным средством лечения редкой детской болезни – гипофизарной карликовости.

Еще одно перспективное направление в медицине, связанное с рекомбинантной ДНК, – генная терапия (см. главу 4).

Перенос генов в растения. Первые трансгенные растения были получены с помощью технологии рекомбинантной ДНК в 1982 г. учеными из Института растениеводства в Кельне (ФРГ) и компании Monsanto (США), а история их промышленного использования насчитывает около 15 лет.

До последнего времени большинство выращиваемых сельском хозяйстве трансгенных сортов растений содержали либо ген устойчивости к гербицидам (71%), либо ген устойчивости к вредителям (18%) и лишь немногие (11%) – оба гена одновременно. Сейчас создаются генетически модифицированные растения, которые будут устойчивы не только к биотическим факторам (фитопатогенным вирусам, бактериям, грибам, нематодам и насекомым), но и к факторам абиотическим (засухе, заморозкам, засолению и т.д.). Эти генетически модифицированные растения будут также обладать пониженной аллергенностью и повышенной пищевой ценностью и усвояемостью. Так, уже созданы салат с увеличенным содержанием железа, обогащенная лизином кукуруза, рис, содержащий большее количество триптофана, а также “золотой рис”, названный так из-за ярко-желтой окраски эндосперма, в составе которого много β-каротина.

Чтобы дать представление о способах создания генетически модифицированных растений, на рис. 3.13 приведена принципиальная схема получения трансгенного табака, устойчивого к вирусам [46]. В качестве основных элементов генетической конструкции использованы гены неспецифической нуклеазы из генома бактерии Serratia marcescens и панкреатической рибонуклеазы быка, которые обладают противовирусной активностью. На первом этапе осуществляется выделение трансгена из геномной ДНК (или кДНК) организма-донора. На рис. 3.13 приведены два основных варианта генетических конструкций: содержащих белок-кодирующие трансгены (конструкция 1) или участки генов, расположенные в антисмысловой ориентации (конструкции 2 и 3). Использованы следующие обозначения: RB, LB – повторы, маркирующие участок ДНК в векторе, который переносится в геном растений ферментами агробактерии; NPTII – ген, экспрессия которого позволяет растениям-трансформантам расти на антибиотике канамицине; РНКаза – ген панкреатической рибонуклеазы быка; ПДГ – участки гена пролиндегидрогеназы арабидопсиса, размещенные в антисмысловой ориентации; pMAS, p35S – промоторы, управляющие экспрессией трансгенов. В конструкции использован промотор гена маннопинсинтазы (pMAS), обеспечивающий средний уровень экспрессии трансгена в листьях и корнях растения и высокий в клетках, окружающих поврежденные ткани.

Рис. 3.13. Схема получения генетически модифицированных вирусоустойчивых растений табака.

Использованный способ трансгеноза определяется тем, что табак относится к двудольным растениям, для которых наиболее эффективным способом генетической трансформации считается перенос генетического материала с помощью почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens. Специфические белковые комплексы агробактерий вырезают генетическую конструкцию, переносят ее из бактерии в клетку растений и встраивают в геномную ядерную ДНК. Затем кусочки листьев табака, обработанные суспензией агробактерий, помещали на среды, содержащие гормоны роста растений и один из антибиотиков. Для отбора трансформантов в данном случае был использован ген неомицинфосфотрансферазы II (NPTII), обеспечивающий устойчивость клеток растений к антибиотику канамицину.

Для однодольных растений применяются другие способы доставки векторов с целевыми генами – например, баллистический метод (метод ДНК-пушки). В этом случае векторная ДНК наносится на микроскопические металлические частицы, которые затем выстреливаются в растительную мишень (кусочки листьев).

В табл. 3.5 показаны объемы посевных площадей, занятых трансгенными культурами (по данным International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications (ISAAA) за 2006 г.). Как видим, с момента появления первых генетически модифицированных растений прошло более 25 лет, а площади под ними перешагнули рубеж 100 млн. га. За это время не было зарегистрировано ни одного научно подтвержденного случая отрицательных эффектов ГМО или продуктов с генетически модифицированными компонентами на человека или окружающую среду. Однако внесение в растения чужеродной ДНК из микроорганизмов или животных продолжает вызывать возражения у противников генной инженерии.

Таблица 3.5. Посевные площади, занятые трансгенными растениями в 2006 г. (по данным [47]).

Их опасения помогает рассеять еще один вариант создания генетически модифицированных растений, при котором генетическая конструкция не содержит трансгенов, кодирующих белок. В этом случае используется феномен РНК-интерференции (о нем мы будем говорить в следующей главе), позволяющий отключить или снизить активность одного из собственных генов растения. Принципиальная схема выключения гена-мишени выглядит так: выделяется необходимый фрагмент ДНК из генома и помещается в генетическую конструкцию в перевернутом (антисмысловом) положении. Такая конструкция синтезирует РНК, которая ничего не кодирует, но связывается с мРНК гена-мишени и по механизму РНК-интерференции запускает целый каскад событий – остановку трансляции, разрушение мРНК и резкое снижение или даже полное прекращение экспрессии гена-мишени.

Перенос генов животных.Первыми из генов животных были введены в бактерию гены шпорцевой лягушки Xenopus laevis. Эти гены хорошо изучены и легко поддаются идентификации. Когда их ввели в клетки штамма E. coli, устойчивого к тетрациклину, они устойчиво реплицировались в новом окружении, причем у полученных клонов ДНК соединяла в себе характеристики X. laevis и E. coli.

В настоящее время уже умеют переносить гены от одного животного к другому и, как мы видели выше, от животного к растениям. Получены «трансгенные» мыши, свиньи, овцы, коровы и рыбы. Существует несколько методов трансгеноза целевых генов у животных. Первый метод связан с прямой инъекцией ДНК в оплодотворенную яйцеклетку вида-реципиента. Кроме того можно использовать в качестве вектора вирус, который, проникнув в клетку, внесет с собой соответствующий ген. Третий метод связан с использованием неспециализированных стволовых клеток эмбриона. Гены вводят в стволовые клетки путем инъекции или с помощью вируса, а полученные трансгенные клетки инъецируют другому зародышу, который включает их в свои ткани.

В животноводстве использование гормона роста, полученного биотехнологическим путем, позволило повысить удои молока… Получена вакцина против герпеса у свиней, созданная с помощью генетически измененного вируса.

Реализуются проекты создания трансгенных млекопитающих, способных синтезировать факторы свертывания человеческой крови и другие жизненно важные для нас продукты и выделять их в составе своего молока. Широкомасштабное развитие такой биотехнологии сэкономило бы огромные количества донорской крови, запасы которой ограничены и могли бы использоваться более эффективно.

В конце 2007 г. в Научно-практическом центре НАН Беларуси по животноводству объявлено, что в ходе выполнения российско-белорусского проекта «Создание высокоэффективных и биологически безопасных лекарственных препаратов нового поколения на основе белков человека, получаемых из молока трансгенных животных» получены два трансгенных козленка с геном лактоферрина человека – белка, отвечающего за иммунитет. Предварительные расчеты показывают, что при кормлении новорожденных козьим молоком с лактоферрином детская смертность в России и Беларуси снизится в десять раз. Кроме того, на основе лактоферрина планируется создать высокоэффективные лекарственные препараты 4-го поколения, косметику и специальные продукты питания, повышающие иммунитет человека любого возраста.

Биотехнология и биобезопасность. Если экономическая выгода от использования ГМО в целом очевидна, то их безопасность по-прежнему вызывает жаркие споры, давно вышедшие за пределы лабораторий и научных форумов. Особенно это касается генетически модифицированных растений, бесконтрольное широкомасштабное использование которых может быть, в принципе, чревато неблагоприятными последствиями для окружающей среды и здоровья человека. К числу таких потенциальных опасностей мировое сообщество относит [48]:

· разрушительное воздействие на биологические сообщества и утрата ценных биологических ресурсов в результате засорения местных видов генами, перенесенными от ГМО;

· создание новых более вредоносных паразитов, прежде всего сорняков, и усиление вредоносности уже существующих;

· выработка веществ, которые могут быть токсичными для организмов, не являющихся их мишенями, живущих или питающихся на ГМО;

· неблагоприятное воздействие на экосистемы токсичных веществ, производных неполного разрушения опасных химикатов (поскольку, как мы видели, большинство создаваемых в настоящее время ГМО – это формы, устойчивые к гербицидам).

Во избежание негативных последствий от бесконтрольного применения генетически модифицированных организмов, 29 января 2000 года в Монреале (Канада), более 130 стран приняли Протокол по биологической безопасности. Он называется “Картахенский протокол по биологической безопасности” по имени г. Картахена (Колумбия), который принимал участников Чрезвычайной конференции, подписавших в 1999 г. Конвенцию по биологическому разнообразию (КБР). Цель этого первого Протокола к КБР состояла в том, чтобы внести вклад в безопасную передачу живых модифицированных организмов, пересекающих международные границы, безопасное обращение с ними и их безопасное применение. К числу таких организмов относятся растения, животные и микробы, полученные с помощью методов генной инженерии. Кроме того, Протокол по биологической безопасности имеет своей целью предотвращение неблагоприятного воздействия на охрану природы и устойчивое использование биологического разнообразия без необходимого нарушения мировой торговли продовольственнымитоварами[49].

Наибольшее беспокойство, как мы видели выше, вызывает вероятность переноса генетического материала трансгенного растения в геномы других дикорастущих или сельскохозяйственных организмов в результате их скрещиваний с ГМО. Для предотвращения таких ситуаций используют растения-самоопылители, изолируют посевы трансгенных растений, тщательно анализируют возможные последствия такого переноса и вероятность фиксации трансгена в природных популяциях и т.д.

Другой «больной вопрос» – это опасность внедрения трансгенов в геномы почвенных микроорганизмов, организмов-симбионтов желудочно-кишечного тракта животных (в том числе человека) и, наконец, в геном самого человека. Человек, как и другие гетеротрофные организмы, постоянно сталкивается с огромным количеством чужеродной ДНК. Часть ее способна попадать в клетки человека. В частности, в 2003 г. немецкие исследователи из Кельна и Эрлангена опубликовали результаты экспериментов, в которых в рацион мышей добавляли препараты, содержащие маркерные ДНК, – их фрагменты были найдены в ядрах некоторых клеток эпителия желудка и кишечника, а также клеток крови (лейкоцитов), печени, почек и селезенки мышей [50]. В других экспериментах, проведенных в университете Уппсала (Швеция) в клетках крови людей–добровольцев, которые питались приготовленным мясом кролика, были найдены небольшие фрагменты как геномной, так и митохондриальной ДНК кролика [51].

Пока еще никому не удалось обнаружить экспрессию проникших с пищей фрагментов генов или какие-то негативные последствия их присутствия. Однако ряд специалистов-биоинформатиков и молекулярных биологов считает, что в исследованиях по ГМО не дается оценка риска от неизученных пока механизмов действия РНК и ДНК. По их мнению, человек является самым уязвимым видом среди живых существ именно потому, что доля внегенной ДНК у него составляет, как мы видели выше, до 98% генома, а механизмы действия малых и микро-РНК еще недостаточно изучены. Об одном из таких эффектов – РНК-интерференции мы будем говорить в главе 4. В последние годы появились публикации о связи РНК с канцерогенезом – как с развитием рака, так и с его предотвращением. С эффектами внеклеточных РНК и ДНК могут быть, по последним данным, связаны некоторые эндокринные нарушения при беременности (см. материалы Рабочего совещания «Оценка эффектов ГМО на здоровье человека», Вена, 23–24 ноября 2003 г. [52]). В целом, по словам Эрика Нейманна, вице-президента по биоинофрматике фирмы Beyond Genomics Inc., «на самом деле мы имеем плохое представление о том, что ген на самом деле делает и где и когда ему это следовало бы делать. Вы можете понимать весь геном в целом и все же понимать менее 1% того, что происходит в клетке» [53].

Опасения противников генетической трансформации растений по части непредсказуемого влияния трансгена на метаболизм и биохимию самого растения (новый ген может вызвать нарушение работы генов, что теоретически способно привести к синтезу метаболита с токсическим или онкогенным эффектом) заставили по-новому взглянуть даже на обычную селекцию. В частности, во многих схемах традиционной селекции используется химический или радиационный мутагенез, ведущий к появлению организмов с непредсказуемыми свойствами, проверка опасности которых не проводится. Как отмечает новосибирский генетик В.Н.Кочетов [46], «даже если мутагенез не используется, любой новый сорт представляет собой оригинальную уникальную комбинацию аллелей (природных вариантов генов), полученную при скрещивании различных (непохожих друг на друга) представителей данного вида. Вероятность того, что в результате этих манипуляций в метаболизме растения нового сорта произойдут сдвиги с негативным эффектом, точно такая же, как при трансгенозе или даже выше. Однако в данном случае никто не обсуждает эту потенциальную опасность всерьез, поскольку селекция сельскохозяйственных растений практикуется человеком тысячи лет и рассматривается в качестве одного из ключевых достижений нашей цивилизации».

Национальный координационный центр биобезопасности. Продолжая обзор применения информационных технологий белорусскими биологами, следует отметить деятельность Национального координационного центра биобезопасности, который проводит большую работу по разъяснению реального положения дел в сфере создания и использования генетически модифицированных организмов… Центр организован на базе Института генетики и цитологии НАН Беларуси в 1998 г. для предоставления информации заинтересованным министерствам и республиканским органам государственного управления, международным и национальным организациям по биобезопасности и средствам массовой информации по законодательству, научным исследованиям, полевым испытаниям, ввозе/вывозе и коммерческом использовании ГМО и их продуктов в Беларуси. Среди прочих информационных материалов на сайте центра представлены различные национальные и международные документы, относящиеся к проблемам биобезопасности, содержатся ответы на наиболее часто задаваемые вопросы по биобезопасности и генно-инженерной деятельности, а также приведены ссылки на национальные и международные Web-сайты организаций и учреждений по биобезопасности, другие ссылки по вопросам биобезопасности и биотехнологии [54]. Кроме того, с 2006 г. при центре действует хозрасчетная лаборатория по тестированию наличия генетически модифицированных компонентов в сельскохозяйственной продукции и продуктах питания, аккредитованная Госстандартом для проведения таких работ.