Лекция: ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ ФЕРМЕНТЫ

В различных пищевых технологиях долгое время применялись лишь препараты свободных ферментов, срок использования которых — один производственный цикл. Однако достижения молекулярной биологии, биохимии и энзимологии привели к тому, что в настоящее время строе­ние и функции многих ферментов изучены очень детально и это позво­лило создать теоретическую базу для производства ферментов пролон­гированного действия или иммобилизованных ферментов, т. е. фикси­рованных или связанных ферментных препаратов.

Сущность иммобилизации ферментов заключается в присоединении их в активной форме тем или иным способом к инертной матрице (обыч­но это нерастворимый полимерный носитель).

Иммобилизацию фермента можно определить и как включение мо­лекулы фермента в какую-либо изолированную фазу, которая отделена от фазы свободного раствора, но способна обмениваться находящимися в ней молекулами субстрата, эффектора или кофактора.

Фаза фермента обычно нерастворима в воде и часто представляет со­бой высокомолекулярный гидрофильный полимер, например, целлюлозу, полиакриламид, сефарозу и т. п.

Принципы и способы иммобилизации.Включение фермента в изоли­рованную фазу осуществляют различными способами: фермент может быть ковалентно связан с этой фазой, адсорбирован на ней или физичес­ки включен в нее.

Возможны следующие способы иммобилизации фермента.

1. Ковалентное связывание. Молекула фермента ковален-тно связывается с нерастворимым полимером. Полимер может быть в виде порошка или в форме пленки. Иногда молекулы фермента соеди­няются ковалентными связями друг с другом или с каким-либо инерт­ным белком; при этом образуется нерастворимый, но активный поли-

мерный фермент (рис. 8.11).

2. Электростатическое
связывание. Этот способ иммоби­-
лизации основан на использовании элек-­
тростатических или других нековалент-
ных механизмов связывания (рис. 8.12).

3. Сополимеризация с по-­
мощью многофункциональ-­
ных реагентов. Связывание моле-­
кул фермента с белками (например, с
альбумином) или друг с другом осуще-­
ствляется за счет использования опре-­
деленных реагентов. В качестве такого
многофункционального реагента часто
используют глутаровый альдегид, геле-
образующее действие которого извест-­
но давно. В этом способе необходимо
избегать взаимодействия реагента с ак-­
тивным центром фермента и ингибиро-
вания последнего (рис. 8.13).

4. Включение в полимер. В этом способе фермент не при­креплен к полимеру, но удерживается внутри него, поскольку последний образует вокруг фермента сетеобразную матрицу (рис. 8.14). Ячейки этой матрицы настолько малы, что молекула фермента не может освободить­ся из сети, но в то же время достаточно велики для проникновения низ­комолекулярных субстратов. Примером такого способа иммобилизации могут служить:

а) включение в липосомы, когда фермент находится в водном раство­-
ре, окруженном фосфолипидным барьером (рис. 8.15);

б) гидрофобное взаимодействие, когда фермент «погружен» в гидро­-
фобную часть двойного липидного слоя (рис. 8.16).

5. Инкапсулирование. Включение фермента в органическую или неорганическую капсулу, которая представляет собой полупроница­емую мембрану (рис. 8.17).

Выбор способа иммобилизации.Искусство иммобилизации фермен­тов заключается в правильном выборе подходящего метода. Этот выбор

определяется целым рядом факторов, многие из которых невозможно вы­явить до тех пор, пока метод не будет опробован.

Первичный отбор осуществляется обычно эмпирическим путем. Сна­чала нужно решить, необходим ли для прикрепления фермента какой-либо специфический носитель, не будет ли процедура иммобилизации инактивировать фермент и сможет ли иммобилизованный фермент дей­ствительно функционировать в тех условиях, при которых его предстоит использовать.

Поэтому для успешной иммобилизации следует по возможности при­нять во внимание следующие факторы:

— фермент должен быть стабильным в условиях протекания реакции;

— реагенты, образующие поперечные сшивки, не должны взаимодейство­-
вать с химическими группировками активного центра. В связи с этим
поперечно-сшивающий реагент должен быть как можно больших раз­-
меров, что будет препятствовать его проникновению в активный центр;

— всегда, когда это осуществимо, необходимо тем или иным способом
защищать активный центр фермента (например, обработка тиоловых
ферментов глутатионом или цистеином);

— процедура промывания для удаления «непришитого» фермента не дол­-
жна оказывать вредного влияния на иммобилизованный фермент;

— полимерная матрица не должна являться субстратом для иммобили-­
зованного фермента;

— необходимо, наконец, учитывать механические свойства носителя, осо­-
бенно его механическую прочность и физическую форму.

Процесс иммобилизации фермента можно продемонстрировать на примере связывания глюкоамилазы с носителем — ацетилэтилцеллю-лозой.

Носитель выдерживают сутки в дистиллированной воде для набуха­ния. Далее к набухшей ацетилэтилцеллюлозе добавляют сначала натрий-ацетатный буфер с рН 5,5, а затем раствор очищенного фермента; после перемешивания к смеси добавляют поперечно-сшивающий агент — глу-таровый альдегид. Через несколько часов полученный препарат промы­вают последовательно натрий-ацетатным буфером и раствором хлорис­того натрия для удаления несорбированного на носителе фермента. Им­мобилизованный таким образом фермент хранится под слоем воды или буфера при 3-5°С.

В настоящее время разработаны методы иммобилизации множества ферментов. Один и тот же фермент можно иммобилизировать несколь­кими методами. Например, глюкозоизомеразу из S. phaeochromogenes можно иммобилизовать на различных носителях: пористом алюминии, ДЭАЭ-целлюлозе, ДЭАЭ-крахмале и др. Лактатдегидрогеназу можно включить в гель, прикрепить к носителю поперечной сшивкой; аспара-гиназу — прикрепить к носителю сорбционным путем или химической (ковалентной) связью. В табл. 8.4 представлены некоторые методы им­мобилизации для различных ферментов.

Влияние иммобилизации на ферментативную активность.Иммобили­зация часто приводит к резким изменениям основных параметров фер­ментативной реакции: максимальной скорости (Vmax); константы Ми-хаэлиса (Kmax); оптимума рН и температуры, а также отношения к инги­биторам.

Степень и природа этих изменений зависят не только от использу­емого метода иммобилизации, но и от типа ферментативной реакции. Большое влияние на ферментативную активность может оказывать по­лимерная матрица, причем это влияние может проявляться как в виде воздействия на микроокружение фермента, так и непосредственно на саму молекулу фермента. Кроме того, сами условия иммобилизации (значение рН, присутствие свободных радикалов, окисляющих аген­тов и т. п.) могут приводить к частичной или полной инактивации фер­мента.

При рассмотрении влияния иммобилизации на ферментативную ак­тивность одним из важных является вопрос об эффективных кинетичес­ких параметрах.

Параметры Kmax и Vmax, используемые для характеристики каталитичес­ких свойств ферментов в разбавленных растворах (см. разд. 8.2), не могут быть применены в их строгом математическом значении для характери­стики иммобилизованных ферментов, т. к. наблюдаются существенные отклонения от гиперболической субстратной кривой, описываемой урав­нением Михаэлиса—Ментен, и искривления прямолинейных графиков в двойных обратных координатах (уравнение Лайнуивера-Берка).

По этой причине в случае иммобилизованных ферментов лучше за­ново определить физический смысл данных кинетических параметров. Ранее с этой целью использовался параметр «кажущаяся» Кm, но позднее было предложено пользоваться двумя константами: Km и VS.

VS — самая высокая скорость, которую можно достичь (теоретичес­ки) в данной системе, т. е. когда фермент полностью насыщен субстра­том. Следовательно, этот параметр отражает исходные свойства иммо­билизованного фермента, но на него могут влиять диффузионные ог­раничения.

Km — такая концентрация субстрата, при которой скорость реакции равна VS/2. Этот параметр отражает реальные свойства субстрата и зави­сит от эффекта распределения и диффузионных ограничений.

Величина Кm (кажущаяся) не может отражать истинного положения, т. к. варьирует в зависимости от выбранного диапазона концентраций суб­страта. Например, ограничение диффузии субстрата сильнее проявляет­ся при низких концентрациях субстрата, а эффект распределения более выражен при низких ионных силах. От этих двух факторов зависит види­мая легкость связывания фермента с субстратом, и поэтому они оказы­вают существенное влияние на параметр Кm (кажущаяся).

Необходимо также учитывать и возникновение кооперативных эффектов в поведении иммобилизованных ферментов в ответ на из­менение концентрации субстрата. Иммобилизованные ферменты (в от­личие от аллостерических, которые проявляют или только положитель­ную, или только отрицательную кооперативность) способны обнаружи­вать оба вида кооперативности в зависимости от рН и микроокружения. Кооперативные эффекты имеют важное значение, т. к. позволяют выя­вить как значительные изменения скорости реакций в небольшом диа­пазоне концентраций субстрата, так и малые изменения скорости реак­ции в других, очень широких диапазонах концентраций субстрата.

Применение иммобилизованных ферментов.Иммобилизованные ферменты как катализаторы многоразового действия можно использовать, в основном, для трех практических целей: аналитических, лечебных и пре­паративных.

При решении вопроса о целесообразности использования системы с иммобилизованным ферментом следует руководствоваться следующими критериями: эффективностью, стоимостью и возможностью осуществить процесс с помощью другой системы.

В случае препаративного (промышленного) применения основную роль играет стоимость, а также возможность автоматизации процесса. Несмотря на большие потенциальные возможности использования им­мобилизованных ферментов в производстве, в настоящее время реали­зованы лишь немногие, например:

—разделение D- и L-аминокислот, основанное на использовании плес­-
невой аминоацилазы (Н. Ф. 3.5.1.14), иммобилизованной на ДЭАЭ-
сефадексе;

—получение сиропов с высоким содержанием фруктозы с использова­-
нием глюкозоизомеразы (Н.Ф.5.3.1.18), иммобилизованной на целю-­
лозном ионообменнике;

—возможно использование иммобилизованных ферментов при произ­-
водстве сыров, стабилизации молока и удалении лактозы из молоч­-
ных продуктов.