Лекция: Генные технологии
Генные технологии основаны на методах молекулярной биологии и генетики, связанных с целенаправленным конструированием новых, не существующих в природе сочетаний генов. Генные технологии зарождались в начале 70-х годов XX в. как методы рекомбинантных ДНК, названные генной инженерией.
Основная операция генной технологии заключается в извлечении из клеток организма гена, кодирующего нужный продукт, или группы генов и соединение их с молекулами ДНК, способными размножаться в клетках другого организма.
На начальной стадии развития генных технологий был получен ряд биологически активных соединений — инсулин, интерферон и др. Современные генные технологии объединяют химию нуклеиновых кислот и белков, микробиологию, генетику, биохимию и открывают новые пути решения многих проблем биотехнологии, медицины и сельского хозяйства.
Основная цель генных технологий — видоизменить ДНК, закодировав ее для производства белка с заданными свойствами. Современные экспериментальные методы позволяют анализировать и идентифицировать фрагменты ДНК и генетически видоизмененной клетки, в которые введена нужная ДНК. Над биологическими объектами осуществляются Целенаправленные химические операции, что и составляет основу генных технологий.
Генные технологии привели к разработке современных методов анализа генов и геномов, а они, в свою очередь, — к синтезу, т.е. к конструированию новых, генетически модифицированных микроорганизмов.
К настоящему времени установлены нуклеотидные последовательности разных микроорганизмов, включая промышленные штаммы, и те, которые нужны для исследования принципов организации геномов и для понимания механизмов эволюции микробов. Промышленные микробиологи, в свою очередь, убеждены, что знание нуклеотидных последовательностей геномов промышленных штаммов позволит «программировать» их на то, чтобы они приносили большой доход.
Клонирование эукариотных (ядерных) генов в микробах и есть тот принципиальный метод, который привел к бурному развитию микробиологии. Фрагменты геномов животных и растений для их анализа клонируют именно в микроорганизмах. Для этого в качестве молекулярных векторов — переносчиков генов — используют искусственно созданные плазмиды, а также множество других молекулярных образований для выделения и клонирования.
С помощью молекулярных проб (фрагментов ДНК с определенной последовательностью нуклеотидов) можно определять, скажем, заражена ли донорская кровь вирусом СПИДа. А генные технологии для идентификации некоторых микробов позволяют следить за их распространением, например внутри больницы или при эпидемиях.
Генные технологии производства вакцин развиваются в двух основных направлениях.
Первое — улучшение уже существующих вакцин и создание комбинированной вакцины, т.е. состоящей из нескольких вакцин.
Второе направление — получение вакцин против болезней: СПИДа, малярии, язвенной болезни желудка и др.
За последние годы генные технологии значительно улучшили эффективность традиционных штаммов-продуцентов.
Например, у грибного штамма-продуцента антибиотика цефалоспорина увеличили число генов, кодирующих экспандазу, активность которой задает скорость синтеза цефалоспорина. В итоге выработка антибиотика возросла на 15—40%.
Проводится целенаправленная работа по генетической модификации свойств микробов, используемых в производстве хлеба, сыроварении, молочной промышленности, пивоварении и виноделии, чтобы увеличить устойчивость производственных штаммов, повысить их конкурентоспособность по отношению к вредным бактериям и улучшить качество конечного продукта.
Генетически модифицированные микробы приносят пользу в борьбе с вредными вирусами и микробами и насекомыми. Вот примеры. В результате модификации тех или иных растений можно повысить их устойчивость к инфекционным болезням. Так, в Китае устойчивые к вирусам табак, томаты и сладкий перец выращивают уже на больших площадях. Известны трансгенные томаты, устойчивые к бактериальной инфекции, картофель и кукуруза, устойчивые к грибкам.
В настоящее время трансгенные растения промышленно выращиваются в США, Аргентине, Канаде, Австрии, Китае, Испании, Франции и Других странах. С каждым годом увеличиваются площади под трансгенными растениями. Особенно важно использовать трансгенные растения в странах Азии и Африки, где наиболее велики потери урожая от сорняков, болезней и вредителей и в то же время больше всего не хватает продовольствия.
Не приведет ли широкое внедрение в практику генных технологий к появлению еще не известных эпидемиологам заболеваний и других нежелательных последствий? Практика показывает, что генные технологии с начала их развития по сей день, т.е. в течение более 30 лет, не принесли ни одного отрицательного последствия. Более того, оказалось, что все рекомбинантные микроорганизмы, как правило, менее вирулентны, т.е. менее болезнетворны, чем их исходные формы. Однако биологические феномены таковы, что о них никогда нельзя с уверенностью сказать: этого никогда не случится. Более правильно говорить так: вероятность того, что это случится, очень мала. И тут как безусловно положительное важно отметить, что все виды работ с микроорганизмами строго регламентированы, и цель такой регламентации — уменьшить вероятность распространения инфекционных агентов. Трансгенные штаммы не должны содержать генов, которые после их переноса в другие бактерии смогут дать опасный эффект.
Генная инженерия.
На основании достижений молекулярной биологии, биохимии и генетики в последние десятилетия интенсивно развивает- ся новое направление в генетике — генная инженерия, целью которой является конструирование генетических структур по заранее намеченному плану, соз- дание организмов с новой генетической программой путем переноса генетической информации из одного организма в другой.
2.1. Методы генной инженерии были разработаны в 60-70-х годах ХХ века. Они включают следующие основные этапы:
1) получение генетического материала (выделение природных генов или химический их синтез);
2) включение этих генов в автономно реплицирующуюся генетическую струк- туру (векторную молекулу) и создание рекомбинантной ДНК;
3) введение рекомбинантных молекул ДНК в клетку-реципиент и включение ее в хромо- сомный аппарат;
4) отбор трансформированных клеток, в геном которых включен переносимый ген.
2.2. В настоящее время применяют несколько способов получения генов для пересадки. Если полностью расшифрована последовательность нуклеотидов, то ген может быть синтезирован химическим путем.
Впервые искусственный ген аланиновой т-РНК, состоящий из 77 нуклеотидов, был синтезирован индийским ученым Г. Корана (1970г.). В 1976 г. был синтезирован ген тирозиновой т-РНК, состоящий из структурной и регуляторной частей (промотор и терминатор), который при введении в бактериальную клетку нормально функционировал. Однако химическим способом удается синтезировать только небольшие по размеру гены прокариот. Синтез сложных генов осуществляют с помощью процессов обратной транскрипции, в основе которых лежит метод ферментативного синтеза. Выделяют и-РНК, и на ней, как на матрице, с помощью фермента ревертазы (обратной транскриптазы) синтезируется комплементарная ей нить ДНК, а затем ее реплицируют (получают комплементарную цепочку). Гены, синтезированные с помощью ревертазы, не имеют регуляторной части и промотора и, вследствие этого, они не могут функционировать в животных клетках. При переносе в бактерию к структурным генам присоединяют промотор микробной клетки, после чего транскриптон начинает работать. Полученные различными способами гены соединяются с векторны ми молекулами, которыми чаще служат плаз- миды бактерий. Кроме плазмид в качестве век- тора используются фаги и вирусы. Они переда- ют генетическую информацию посредством трансдукции. Кольцевая молекула ДНК плаз- миды разрывается той же рестриктазой, что и выделенный ген. В области разрыва образуются липкие концы, комплементарные липким кон- цам пересаживаемого гена. Фермент лигаза сшивает липкие концы гена и плазмиды. Полу- чается рекомбинантная молекула ДНК, которая обладает способностью проникать в клеткуреципиент. Комбинируя различные рестриктазы и лигазы, можно разрезать нить ДНК в разных местах и получать рекомбинантные молекулы.
5′_________________ 3′
ГААТТ Ц
Ц ТТААГ
3′_________________ 5′
5′____________ 3′
ААТТ Ц
«Липкие концы»
Ц ТТАА
5′ _________________3′
Рис. 37.
Схема действия рестриктаз.
2.4. Так как не во все клетки попадут рекомбинированные молекулы ДНК, то с помощью специальных методов (чаще всего на селективных пита- тельных средах) проводят отбор трансформированных клеток (с перенесен- ным геном). В дальнейшем проводят клонирование — размножение клеток с рекомбинантной ДНК — и получают клон клеток с заданными свойствами.
2.5. Методами генной инженерии получены клоны клеток кишечной палочки, способные продуцировать соматотропин и инсулин в промышленных масштабах. Обычно эти препараты получают из соответствующих желез животных. Преимущества препаратов, полученных методами генной инже- нерии, заключается в возможности синтеза их в достаточных количествах, биохимически чистыми и абсолютно стерильными. Генная инженерия — это современное интенсивно развивающееся на- правление генетики. С использованием ее методов созданы растения, способные усваивать атмосферный азот, микроорганизмы, разрушающие углеводороды нефти и синтезирующие из них пищевые белки. Разработаны методы внесения генов патогенных вирусов в бактерии и приготовление из синтезированных ими белков противовирусных сывороток. В будущем генная инженерия поможет человечеству избавиться от ряда наследственных заболеваний, посредством пересадки в зародыш недостающих или замены мутантных генов. В настоящее время накапливаются клонированные гены человека, некоторых животных и растений, т.е. создаются банки генов.
2.6. Объединение чужеродных генов в одной клетке чревато опасными последствиями. Плазмиды способны соединяться в любых комбинациях, независимо от видовых и иммунологических барьеров. Конструирование но- вых разновидностей болезнетворных бактерий, устойчивых к лекарственным препаратам, может привести к возникновению серьезных эпидемий. В 1973 г. была проведена первая международная конференция по предупреждению опасных последствий генной инженерии. Опыты на время были запрещены. В 1975 г. Р. Кертис получил мутант кишечной палочки, нежизнеспособный в естественных условиях в связи с нарушением синтеза оболочки. Неопасная для человека и животных бактерия может жить только в лабораторных усло- виях, и опыты по генной инженерии были продолжены. Все исследования по генной инженерии проводятся в специальных лабораториях, строжайше изо- 5152 лированных от окружающей среды, с обязательным соблюдением опреде- ленных мер безопасности.
2.7. Будущее генной инженерии базируется на следующих достиже- ниях молекулярной биологии:
1) возможность с помощью химических мутагенов вызывать специфические мутации в определенных генных локусах;
2) возможность переноса генетической информации неполовым путем у эукариот (трансформация или трансдукция), что позволит проводить генную терапию заболеваний;
3) замена дефектных генов с использованием ДНК вирусов в качестве переносчиков;
4) включение в геном человека искусственно синтезированных генов.