Лекция: Бактериальные клетки не имеют специальных органов питания, т. е. являются голофитными.

Поступление питательных веществ в микробную клетку мо­жет происходить за счет:

• осмоса и диффузии по градиенту концентрации без затрат энергии;

• пассивного транспорта, который также осуществляется по градиенту концентрации с помощью белков-переносчиков, но без затрат клеткой энергии, и отличается от диффузии боль­шей скоростью;

• активного транспорта, который идет против градиента кон­центрации с затратой энергии и возможным частичным рас­щеплением субстрата, осуществляется белками-переносчиками или ферментами — пермеазами.

По источникам углерода, необходимого для построения биопо­лимеров, бактерии делятся на следующие группы:

• автотрофы — микроорганизмы, которые используют как един­ственный источник углерода углекислый газ и не нуждаются в сложных органических соединениях;

• гетеротрофы — микроорганизмы, которые используют в каче­стве источника углерода разнообразные органические углеро-досодержащие соединения (углеводы, углеводороды, амино­кислоты, органические кислоты) как биологического, так и небиологического происхождения.

В зависимости от источника получения энергии микроорганизмы делятся:

• на фототрофные, способные использовать солнечную энергию,

• хемотрофные, получающие энергию за счет окислительно-вос­становительных реакций.

В зависимости от природы доноров электронов:

• фототрофные литотрофы;

• хемотрофные литотрофы — использующие в качестве доноров электронов неорганические соединения;

• фото- и хемоорганотрофы — использующие только органические соединения. К последним принадлежит значительное боль­шинство бактерий, в том числе патогенные для человека виды. По источникам азота:

• азотфиксирующие микроорганизмы — способны усваивать моле­кулярный азот атмосферы;

• микроорганизмы, ассимилирующие неорганический азот:

• солей аммония — аммонифицирующие;

• нитратов — нитратредуцирующие;

• нитритов — нитритредуцирующие.

Однако большинство патогенных для человека микроорганиз­мов способны ассимилировать только азот органических соеди­нений.

Микроорганизмы, способные синтезировать все необходимые им органические соединения (углеводы, аминокислоты и др.) из ука­занных компонентов, называются прототрофами.

Микроорганизмы, неспособные синтезировать какое-либо из необ­ходимых соединений и ассимилирующие их в готовом виде из ок­ружающей среды или организма хозяина (человека, животного), называются ауксотрофами по этому соединению. Чаще всего ими являются патогенные или условно-патогенные для чело­века микроорганизмы.

8.

Метаболизм (обмен веществ) бактерий представляет собой совокупность 2 взаимосвязанных противоположных процессов: катаболизма и анаболизма.

Катаболизм (диссимиляция) — распад веществ в процессе фер­ментативных реакций и накопление выделяемой при этом энергии в молекулах АТФ.

Анаболизм (ассимиляция) — синтез веществ с затратой энергии. Особенности метаболизма у бактерий состоят в том, что:

• его интенсивность имеет достаточно высокий уровень, что воз­можно обусловлено гораздо большим соотношением поверхно­сти к единице массы, чем у многоклеточных;

• процессы диссимиляции преобладают над процессами ассимиляции;

• субстратный спектр потребляемых бактериями веществ очень широк — от углекислого газа, азота, нитритов, нитратов до ор­ганических соединений, включая антропогенные вещества — загрязнители окружающей среды (обеспечивая тем самым про­цессы ее самоочищения);

• бактерии имеют очень широкий набор различных ферментов — это также способствует высокой интенсивности метаболиче­ских процессов и широте субстратного спектра.

Ферменты бактерий по локализации делятся на 2 группы:

• экзоферменты — ферменты бактерий, выделяемые во внешнюю среду и действующие на субстрат вне клетки (протеазы, поли­сахариды, олигосахаридазы);

• эндоферменты — ферменты бактерий, действующие на субстра­ты внутри клетки (расщепляющие аминокислоты, моносахара, синтетазы).

Синтез ферментов генетически детерминирован, но регуляция их синтеза идет за счет прямой и обратной связи, т. е. для одних — репрессируется, а для других — индуцируется субстратом. Ферменты, синтез которых зависит от наличия соответствую­щего субстрата в среде (бета-галактозидаза, бета-лактамаза), называются индуцибельными.

Другая группа ферментов, синтез которых не зависит от нали­чия субстрата в среде, называется конститутивными (фермен­ты гликолиза). Их синтез имеет место всегда, и они всегда со­держатся в микробных клетках в определенных концентрациях. Изучают метаболизм бактерий с помощью физико-химических и биохимических методов исследования в процессе культивирова­ния бактерий в определенных условиях на специальных пита­тельных средах, содержащих то или иное соединение в качест­ве субстрата для трансформации.

Такой подход позволяет судить об обмене веществ путем более, детального изучения процессов различных видов обмена (белков, углеводов) у микроорганизмов.

9.Дыхание, или биологическое окисление, основано на окисли­тельно-восстановительных реакциях, идущих с образованием АТФ-универсального аккумулятора химической энергии. Энергия необходима микробной клетке для ее жизнедеятельности. При дыхании происходят процессы окисления и восстановления: окисление — отдача донорами (молекулами или атомами) во­дорода или электронов; восстановление — присоединение водо­рода или электронов к акцептору. Акцептором водорода или электронов может быть молекулярный кислород (такое дыхание называется аэробным) или нитрат, сульфат, фумарат (такое дыхание называется анаэробным — нитратным, сульфатным, фумаратным).

Анаэробиоз (от греч. аег — воздух + bios — жизнь) — жизнедеятельность, протекающая при отсутствии сво­бодного кислорода. Если донорами и акцепторами водорода яв­ляются органические соединения, то такой процесс называется брожением. При брожении происходит ферментативное расщепление органических соединений, преимущественно углеводов, в анаэробных условиях. С учетом конечного продукта расщепления углеводов различают спиртовое, молочнокислое, уксуснокислое и другие виды брожения.

По отношению к молекулярному кислороду бактерии можно разделить на три основные группы: облигатные, т.е. обязатель­ные, аэробы, облигатные анаэробы и факультативные анаэробы.

Синтез биополимеров бактериальной клетки требует энергии. Она образуется в ходе биологического окисления и запасается в виде молекул макроэргов — АТФ и АДФ.

Органеллами дыхания у большинства бактерий являются про­изводные цитоплазматической мембраны — мезосомы, на кото­рых локализуются специальные дыхательные ферменты типа цитохромоксидаз. Тип биологического окисленияявляется одним из ключевых признаков, позволяющих дифференцировать раз­личные микроорганизмы. По этому признаку выделяют 3 груп­пы бактерий:

• 1-я группа — облигатные аэробы, которые способны получать энергию только путем дыхания и нуждаются в молекулярном кислороде как конечном акцепторе электронов. Для них как тип окислительно-восстановительных процессов характерно окисление, при котором конечным акцептором электронов яв­ляется кислород;

• 2-я группа — облигатные анаэробы — бактерии, способные расти только в среде, лишенной кислорода. Для них как тип окисли­тельно-восстановительных процессов характерна ферментация, при которой происходит перенос электронов от субстрата-донора к субстрату-акцептору;

• 3-я группа — факультативные анаэробы — бактерии, способные расти как в присутствии, так и в отсутствие кислорода и ис­пользовать в качестве терминальных акцепторов электронов как молекулярный кислород, так и органические соединения. Среди них могут быть:

• факультативно-анаэробные бактерии, способные переклю­чаться с окисления на ферментацию (энтеробактерии);

• аэротолерантные факультативно-анаэробные бактерии, ко­торые могут расти в присутствии атмосферного кислорода, но не используют его, а получают энергию исключительно с помощью брожения (молочнокислые бактерии).

10.Жизнедеятельность бактерий характеризуется ростом — фор­мированием структурно-функциональных компонентов клетки и увеличением самой бактериальной клетки, а также размноже­нием — самовоспроизведением, приводящим к увеличению ко­личества бактериальных клеток в популяции.

Бактерии размножаются путем бинарного деления пополам, реже путем почкования. Актиномицеты, как и грибы, могут раз­множаться спорами. Актиномицеты, являясь ветвящимися бактериями, размножаются путем фрагментации нитевидных клеток. Грамположительные бактерии делятся путем врастания синтези­рующихся перегородок деления внутрь клетки, а грамотрицательные — путем перетяжки, в результате образования гантелевид-ных фигур, из которых образуются две одинаковые клетки.

Делению клеток предшествует репликация бактериальной хро­мосомы по полуконсервативному типу (двуспиральная цепь ДНК раскрывается и каждая нить достраивается комплементарной ни­тью), приводящая к удвоению молекул ДНК бактериального ядра — нуклеоида.

Репликация ДНК происходит в три этапа: инициация, элон­гация, или рост цепи, и терминация.

Размножение бактерий в жидкой питательной среде.Бактерии, засеянные в определенный, не изменяющийся объем питатель­ной среды, размножаясь, потребляют питательные элементы, что приводит в дальнейшем к истощению питательной среды и пре­кращению роста бактерий. Культивирование бактерий в такой си­стеме называют периодическим культивированием, а культуру — периодической. Если же условия культивирования поддерживаются путем непрерывной подачи свежей питательной среды и оттока такого же объема культуральной жидкости, то такое культивиро­вание называется непрерывным, а культура — непрерывной.

При выращивании бактерий на жидкой питательной среде наблюдается придонный, диффузный или поверхностный (в виде пленки) рост культуры.

Споры бактерий представляют собой бактериальные клетки в состоянии анабиоза и образуются при неблагоприятных условиях внешней среды.

Располагаются внутри клетки терминально, субтерминально или центрально.

Спорообразуюише палочки называются бациллами. В проиессе спорообразования клетка почти полностью теряет во­ду, сморщивается, клеточная стенка уплотняется. Появляется новое вещество — дипиколинат кальция, которое образует комплексы с биополимерами клетки, устойчивые к действию температуры и ультрафиолетовых лучей.

В окружающей среде споры бактерий могут сохраняться года­ми, но при попадании в благоприятные условия спора впиты­вает влагу, комплексы распадаются, дипиколинат разрушается, и спора превращается в вегетативную клетку. Таким образом, споруследует рассматривать не как способ раз­множения, а только как форму существования бактериальной клетки в неблагоприятных условиях.

Преобразования идут по следующей схеме: 1 клетка — 1 спора — 1 клетка, т. е. увеличения количества бактериальных клеток не происходит.

Спорообразование характерно в основном для грамположитель-ных бактерий.

У грамотрицателъных бактерий эквивалентом спорообразова­ния является переход в так называемое некультивируемое со­стояние. Втакой форме они также длительно сохраняются в окружающей среде.

При использовании окраски по Граму споры не воспринимают красителей, поэтому на окрашенном фоне они бесцветны. Ок­рашиваются споры с помощью специальных методов окраски, например по Ожешко или Клейну.

11,12, 14

Методы исследования в микробиологии. Принципы организации, аппаратура и режим работы бактериологической, вирусологической, иммунологической лабораторий. Общие правила взятия, хранения и пересылки материала при микробиологических исследованиях.

Бактериоскопический (микроскопический) метод исследования – совокупность способов изучения морфологических и тинкториальных свойств МБ в исследуемом материале с помощью микроскопии.

Основные цели: 1) установление этиологии болезни 2) морфологическая идентификация возбудителя 3) определение чистоты выделенной чистой культуры.

Оценка метода: метод простой, широко доступный, быстрый, экономичный, но мало чувствителен, мало специфичен (морфология МБ разных видов часто схожа) и небезопасен.

Культуральный (бактериологический) метод исследования — совокупность способов, направленных на выделение и идентификацию чистых культур микроорганизмов (бактерий) с помощью культивирования на питательных средах.

Биологический (экспериментальный) метод исследования — совокупность способов искусственного воспроизведения клинической картины инфекционных болезней или их синдромов на лабораторных животных.

Молекулярно-генетические методы исследования:

Молекулярная гибридизация — процесс, в котором одноцепочечная НК исследуемого микроорганизма (мишень) при взаимодействии с комплементарным фрагментом НК., включающей метку (зонд), образует двухцепочечный комплекс.

Назначение метода: выявление степени сходства различных ДНК.

ПЦР (полимеразная цепная реакция) — что способ быстрого получения множественных копий специфической последовательности ДНК бактерий, грибов, вирусов до количества, достаточного для идентификации другими молекулярно-биологическими методами.

ТРАНСПОРТИРОВКА:

Образцы материала собирают в стерильную посуду, которую маркируют, помещают в специальные биксы или пеналы и направляют в лабораторию.

В сопроводительном документе (направлении) приводят сведения о характере материала, времени его взятия, данные о больном, включающие предполагаемый клинический диагноз и перечисление антибиотиков, использованных в лечении, указывают название учреждения, отделения, направляющего материал.

Транспортировку материала для исследования осуществляют в предельно сжатые сроки. Охлаждение материала в холодильнике при t° 4° (или на льду) позволяет увеличить время до начала исследования на 30—60 мин. Более длительное хранение может привести к гибели возбудителей или изменению количественных соотношений частей микрофлоры. Поэтому в случаях, когда хранение и транспортировка длятся более суток, используют консервант или транспортные (поддерживающие, накопительные) среды и специальные средства, сохраняющие жизнедеятельность микроорганизмов.

БАКТЕРИОЛ. ЛАБ. при лечебно-профилактических учреждениях выполняют анализы, необходимые для постановки и уточнения диагноза инфекционного заболевания, способствуя правильному выбору специфического лечения и определению сроков выписки больного из инфекционной больницы. Предметом для исследования в бактериологических лабораториях являются:

— выделения из организма человека: моча, кал, мокрота, гной, а также кровь, спинномозговая жидкость и трупный материал;

— объекты внешней среды: вода, воздух, почва, продукты питания, смывы с предметов инвентаря, рук и т. п.

В состав бактериологической лаборатории входят: лабораторные комнаты для бактериологических исследований и подсобные помещения; автоклавная или стерилизационная для обеззараживания отработанного материала и заражённой посуды; моечная, оборудованная для мытья посуды; средоварочная для приготовления, розлива, стерилизации и хранения питательных сред; виварий для содержания подопытных животных; материальная для хранения запасных реактивов, посуды, аппаратуры и хозяйственного инвентаря.

В лаборатории имеется место для окраски микроскопических препаратов, где находятся растворы красок, спирт, кислоты, фильтровальная бумага и пр. Каждое рабочее место снабжено газовой горелкой или спиртовкой и банкой с дезинфицирующим раствором. Для повседневной работы лаборатория должна располагать необходимыми питательными средами, химическими реактивами, диагностическими препаратами и другими лабораторными материалами.

Аппаратура для выращивания микроорганизмов, стерилизации и других микробиологических целей

1. Термостат. Аппарат, в котором поддерживается постоянная температура. Оптимальная температура для размножения многих микроорганизмов 37°С. Термостаты бывают суховоздушными и водяными. Используются для культивирования микроорганизмов.

2. Микроанаэростат. Аппарат для выращивания микроорганизмов в анаэробных условиях.

3. Сушильный шкаф (печь Пастера). Предназначен для стерилизации лабораторной посуды и других материалов.

4. Автоклав. Предназначен для стерилизации паром под давлением. В микробиологических лабораториях используются автоклавы разных моделей (вертикальные, горизонтальные, стационарные, переносные).

5. Холодильники. Используются в микробиологических лабораториях для хранения культур микроорганизмов, питательных сред, крови, вакцин, сывороток и прочих биологически активных препаратов при температуре около 4°С. Для сохранения биопрепаратов при температуре ниже 0°С используются низкотемпературные холодильники, в которых поддерживается температура -20°С и ниже.

13. Методы окраски. Окраску мазка производят просты­ми или сложными методами. Простые за­ключаются в окраске препарата одним красителем; сложные методы (по Граму, Цилю — Нильсену и др.) включают последо­вательное использование нескольких красителей и имеют диффе­ренциально-диагностическое значение. Отношение микроорганиз­мов к красителям расценивают как тинкториальные свойства. Существуют специальные методы окраски, которые используют для выявления жгутиков, клеточной стенки, нуклеоида и разных цитоплазматических включений.

При простых методах мазок окрашивают каким-либо одним красителем, ис­пользуя красители анилинового ряда (основные или кис­лые). Если красящий ион (хромофор) — катион, то краситель обладает основными свойствами, если хромо­фор — анион, то краситель имеет кислые свойства. Кис­лые красители — эритрозин, кислый фуксин, эозин. Ос­новные красители — генциановый фиолетовый, кристал­лический фиолетовый, метиленовый синий, основной фуксин. Преимущественно для окраски микроорганизмов используют основные красители, которые более интенсивно связываются кислыми компонентами клетки. Из сухих красителей, продающихся в виде порошков, готовят на­сыщенные спиртовые растворы, а из них — водно-спирто­вые, которые и служат для окрашивания микробных кле­ток. Микроорганизмы окрашивают, наливая краситель на поверхность мазка на определенное время. Окраску основным фуксином ведут в течение 2 мин, метиленовым синим — 5—7 мин. Затем мазок промывают водой до тех пор, пока стекающие струи воды не станут бесцветными, высушивают осторожным промоканием фильтровальной бумагой и микроскопируют в иммерсионной системе. Ес­ли мазок правильно окрашен и промыт, то поле зрения совершенно прозрачно, а клетки интенсивно окрашены.

Сложные методы окраски применяют для изуче­ния структуры клетки и дифференциации микроорганиз­мов. Окрашенные мазки микроскопируют в иммерсион­ной системе. Последовательно нанести на препа­рат определенные красители, различающиеся по химическому составу и цвету, протравы, спирты, кислоту и др.

Существуютнесколько основных окрасок: по Граму, по Цилю-Нельсону, по Ауески, Нейссера, Бури-Гинса.

Люминесцентная (или флюоресцентная) микроскопия.Осно­вана на явлении фотолюминесценции.

Люминесценция — свечение веществ, возникающее после воз­действия на них каких-либо источников энергии: световых, элек­тронных лучей, ионизирующего излучения. Фотолюминесцен­ция — люминесценция объекта под влиянием света. Если осве­щать люминесцирующий объект синим светом, то он испускает лучи красного, оранжевого, желтого или зеленого цвета. В ре­зультате возникает цветное изображение объекта.

Темнопольная микроскопия.Микроскопия в темном поле зре­ния основана на явлении дифракции света при сильном боковом освещении взвешенных в жидкости мельчайших частиц (эффект Тиндаля). Эффект достигается с помощью параболоид- или кардиоидконденсора, которые заменяют обычный конденсор в био­логическом микроскопе .

Фазово-контрастная микроскопия.Фазово-контрастное приспособление дает возможность увидеть в микроскоп прозрачные объекты. Они приобретают высокую контрастность изображения, которая может быть позитивной или негативной. Позитивным фазовым контрастом называют темное изображение объекта в светлом поле зрения, негативным — светлое изображение объек­та на темном фоне.

Для фазово-контрастной микроскопии используют обычный микроскоп и дополнительное фазово-контрастное устройство, а также специальные осветители.

Электронная микроскопия.Позволяет наблюдать объекты, размеры которых лежат за пределами разрешающей способно­сти светового микроскопа (0,2 мкм). Электронный микроскоп применяется для изучения вирусов, тонкого строения различных микроорганизмов, макромолекулярных структур и других субмик­роскопических объектов. И стр.9 практикум