Лекция: Основные способы дифференциальной окраски хромосом.

Q-окраска (флуоресцентная с использованием флюорохромов. Большинство флюорохромов имитирует зеленое, а иногда оранжевое и даже красное свечение. Для исследования хромосом в этих случаях применяют мощные рутинно-кварцевые лампы. Из флюорохромов чаще всего используют производные акридина (акрихин и акрихин-иприт). акрихина иприта). Рисунок каждой хромосомы, окрашенной Q-методом, специфичен по числу, размерам и положению по-разному светящихся сегментов, что и обеспечивает идентификацию всех хромосом. Q-окраска является индикатором хроматина с повышенным содержанием AT-пар оснований, поскольку они интенсивнее флюоресцирует в соответствующих участках хромосомы.

G-окраскаМетодики, с помощью которых получают G-окраску хромосом, разнообразны. Общим для всех них является:

Во-первых, определенная предварительная обработка препаратов хромосом перед окрашиванием; чаще всего применяется предварительная обработка трипсином.

Во-вторых, использование для окрашивания нефлюоресцирующих основных красителей (азуры, метиленовый синий);

По числу, величине и расположению выявляющихся сегментов рисунок G-окраски аналогичен рисунку при Q-окраске. На G-окрашенных хромосомах наблюдаются изменения рисунка линейной дифференцированности хромосом, связанные со степенью митотической конденсации хромосомы.

R-окраска.Рисунок при R-окраске противоположен рисунку при G–окраске. Ключевым моментом выполнения R-окраски является нагревание препаратов хромосом при высокой температуре (78-90С). Окрашивание

С-окраска.Метод основан на кратковременном воздействии на препараты хромосом щелочью. В отличие от предыдущих трех типов дифференциальной окраски при С-окраске в каждой хромосоме человека краситель воспринимает лишь центромерный и околоцентромерный районы во всех хромосомах и длинное плечо Y-хромосомы. По локализации выделяют 4 типа С-гетерохроматина: собственно центромерный, присущий всем хромосомам, гетерохроматин вторичных околоцентромерных перетяжек аутосом 1, 9 и 16, гетерохроматин коротких плеч акроцентрических аутосом, гетерохроматин длинного плеча Y хромосомы. Позволяет лучше, чем какой-либо другой метод, оценивать хромосомный полиморфизм. Используется для уточнения характера хромосомных перестроек, особенно помогая в идентификации перицентромерных инверсий.

Помимо дифференциальной окраски в цитогенетике используют избирательную окраску хромосом.Избирательная окраска – окраска отдельных районов индивидуальных хромосом. Чаще всего метод используется для выявления ядрышкообразующих районов, которые расположены в коротких плечах всех десяти акроцентрических хромосом. В настоящее время применяют метод, основанный на использовании нитрата серебра и проведении процедуры серебрения при нагревании. Называют эту пробу Ag-окраской, что отражает использование соединений серебра. На удачных препаратах хромосомы окрашены в желтый цвет. В коротких плечах акроцентрических хромосом четко выявляются темно-коричневые или черные точечные образования – гранулы серебра. Хотя тонкие механизмы окраски ядрышкообразующих районов хромосом пока не известны, однако установлено, что красяшимся субстратом при Ag-окраске являются не ДНК рибосомных генов и не рРНК, а кислые белки, по-видимому, входящие в структуру ядрышка и связанные с рРНК (рибонуклеопротеиды, являющиеся продуктом активности хромосомы). Поэтому метод серебрения позволяет выявить не всякий ЯО, а лишь функционирующий в предшествующей митозу интерфазе, а интенсивность их окрашивания соответствует интенсивности функционирования.

FISH-окраска(рис.12.8).. В цитогенетике млекопитающих последние годы ознаменованы стремительным развитием новых методов исследований, в основе которых лежит флуоресцентная in situ гибридизация нуклеиновых кислот. Десять-пятнадцать лет назад

возможности исследователя были практически сведены к изучению морфологии и дифференциальной окрашиваемости хромосом и их отдельных районов. Развитие методов, способных на цитологических препаратах визуализировать интересующие последовательности ДНК, резко изменило ситуацию. Метод флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) оказался крайне эффективным инструментом изучения генома человека и других видов млекопитающих, реорганизации хромосом в ходе эволюции, анализа хромосомных перестроек как при малигнизации клеток, так и при врожденных патологиях. Гибридизация in situ дала начало огромному числу методических разработок, которые уже нашли широкое применение в практической медицине, а современная хромосомная диагностика продвинулась значительно дальше самых смелых фантазий цитологов 80-х годов. Значительную роль в развитии новых вариантов FISH сыграл приход новых методов регистрации микроскопических изображений. Замена фотонасадок CCD-камерами (CCD-камерами с высоким уровнем разрешения, охлаждаемыми CCD-камерами с длительным временем накопления сигнала и т.д.) с соответствующим компьютерным обеспечением не просто упростила и ускорила процесс регистрации микроскопических изображений, но и предоставила экспериментатору принципиально новые возможности обработки изображений, записанных в цифровом формате. Такой метод хромосомного анализа позволяет выявлять и идентифицировать любые транслокации материала негомологичных хромосом. Окраска хромосомы более чем одним цветом свидетельствует о наличии транслокации. Цвет хромосомных районов позволяет однозначно определить хромосомы, которые были вовлечены в данные хромосомные перестройки. Имеются в наличии коммерчески доступные наборы меченых ДНК проб и необходимых систем детекции. Метод позволяет проводить быструю идентификацию значительной части внутри- и межхромосомных перестроек.

Классификации хромосом(рис. 12.9)

Для того, чтобы было легче разобраться в сложном комплексе хромосом человека, предлагалось множество способов их классификации (по форме, по размерам и т.д.). В 1960 г. в г. Денвере (Англия) была принята единая классификация хромосом человека, которой до сих пор пользуются все цитогенетики. Согласно Денверской классификации для анализа хромосомы группируются попарно (гомологи) в порядке уменьшения размера и делятся на 7 групп, которые обозначают буквами латинского алфавита от А до G. Как видно на кариограмме, половые Х- хромосомы относятся к группе С. Y-хромосома – к группе G. Для точной идентификации дифференциально окрашенных хромосом используется, так называемая, Парижская номенклатура, принятая в Париже в 1979 году.

2. Изучение интерфазных ядер.

Это экспресс-метод определения X-полового хроматина в интерфазных ядрах клеток слизистой оболочки полости рта (обнаружение телец Барра) или в сегментоядерных лейкоцитах (барабанные палочки)). Для выявления полового хроматина клетки окрашиваются с применением основных красителей (орсеин, краситель Романовского-Гимзы и др.).