Доклад: Молекулярная природа и функционирование наследственных детерминант вирулентности патогенов и резистентности хозяев.

Молекулярное строение и функции генов авирулентности патогенов начали исследовать у бактерий, у которых геном имеет более простое строение, чем у грибов. Было обнаружено, что продукт гена avr10Xanthomonas oryzae, комплементарный гену устойчивости риса Xa10, кодирует периплазматический ферментный белок, гидролизующий фосфодиэфирных связи фосфолипидов, и имеет лидерный пептид, который экскретируется через клеточную мембрану и является элиситором сверхчувствительной реакции у риса. Были изучены также бактериальные белки flg22 жгутиков, hrp фимбрий, Ef-Tu фактора элонгации и ряд других avr генов возбудителей болезней растений бактериальной природы [100].

Неспецифический элиситорный домен flg22 бактериального жгутикового флагеллина, соединяясь с рецептором FLS2 с киназной активностью на плазмалемме, интернализуется путем эндоцитоза в протоплазму растения и активирует ответную реакцию в форме экзоцитозной секреции [169-171]. Кроме флагеллина большинство белков авирулентности содержатся внутри бактерий, и их экскреция происходит только in planta под влиянием растения и посредством особого способа выделения, который получил название секреции III типа. У фитопатогенных грам-негативных бактерий отходящие от стенок фимбрии (пили) обеспечивают прикрепление к клетке хозяина, а по имеющемуся внутри узкому каналу – проникновение эффекторов через стенку и плазмалемму в цитоплазму инфицируемой растительной клетки [156-158].

Несколько позже стали исследовать гены авирулентности у фитопатогенных грибов. Продукт гена Avr9 гриба Cladosporium fulvum, вызывающий защитные реакции у сортов томата, имеющих комплементарный ген Сf9, – пептид, который накапливается в апопласте пораженных листьев и требуется для поглощения азота гифами и выделяется грибом in vitro в условиях азотного голода [162].

У грибов неспецифические элиситоры, включающие экзоферменты, фрагменты хитина, глюканов, распознаются рецепторами плазмалеммы и индуцируют образование папилл, предохраняющих протоплазму от чужеродных веществ. Специфические элиситоры и супрессоры выделяются на поверхность гиф и гаусториев, отщеп­ляются протеазами и доводятся до более мелких молекул, которые с помощью образования пор в мембране (некоторые токсины) или путем эндоцитоза проникают в цитоплазму хозяина и оказывают там свое действие на сигнальные и метаболические процессы [57,97,172-174].

У фитопатогенных оомицетов клонировано несколько AVR-белков. Они имеют сигнальный пептид, следующий за консервативным мотивом RXLR, который подобен сигнальному участку белка малярийного плазмодия, необходимого для переноса белка в цитоплазму клетки хозяина. Полагают, что у оомицетов эта область отвечает за выработку сиг­нала, обеспечивающего вхождение в клетку хозяина, где роль триггера играет фосфоинозитол-3-фосфат [161,175-177].

Исследование другого компонента фитопатосистемы – растения – привело ученых к предположению, что комплементарные генам авирулентности патогенов гены устойчивости растений, или R-гены, несут по крайней мере две функции: 1) рецепторов, узнающих (воспринимающих) элиситоры патогенов, и 2) медиаторов, передающих сигналы с поверхности клетки на геном ядра [172].

Изучение структуры и функций R-генов затруднялось тем, что ядра растений содержат много хромосом. Поэтому успех исследований обеспечила только концентрация усилий ученых всего мира на модельных объектах типа Arabidopsis thaliana, имеющем в гаплоидном наборе 3 хромосомы (1.108 пар оснований, ~100 генов устойчивости) [178]. Впоследствии были получены данные о молекулярном строении генов устойчивости ряда других растениях: льна, риса, пшеницы.

Установлено, что продукты R-генов (R-белки) имеют в своем составе несколько характерных участков [23,179-184]:

• Крупный С-концевой участок. Содержит большое число повторяющихся последовательностей с высоким содержанием лейцина (Leucine-rich repeats – LRR). Каждый повтор состоит из 23-24 аминокислот. Этот гидрофобный сайт имеется во многих белках эукариот и осуществляет межбелковые взаимодействия, т.е. служит рецептором, связывющимся с лигандом – белковым или гликопротеидным элиситором патогена. LRR-домен имеет большие возможности для генетических реорганизаций, рекомбинаций, что приводит к изменению рецепторных свойств молекулы. Гипервариабельная структура участков ДНК, кодирующих повторы, содержащие лейцин, является наиболее подходящей для эволюционного генерирования новых последовательностей. Мутации, меняющие реакцию на заражение авирулентными расами патогенов, часто картируются в этой части гена [185].

• Участок связывания нуклеотидов (Nucleotide Binding Sites – NBS): сигнальная область, связывающаяся с АТФ и ГТФ, вследствие чего она может активировать киназы и сигнальные G-белки [186,187]. Состоит из трех под-участков:

— киназы 1а (в виде петли, связывающей фосфат),

— киназы 2а, связывющей ион металла, необходимого для переноса фосфата,

— киназы 3а, значимой для взаимодействия с пуриновыми основаниями АТФ.

Показано, что NBS-область R-белков растений гомологична генам Ced4 червя Caenohabolitis elegans и Apaf 1 человека, являющихся регуляторами активности каспазы, важного фактора программированной клеточной смерти (апоптоза). Уже говорилось, что реакция сверхчувствительного некроза растений при взаимодействии с авирулентной расой патогена аналогична реакции апоптоза у животных.

• Участок лейциновой «застежки» (Leuzine Zipper Region – LZR): способствует формированию спирализованных структур, обеспечивающих димеризацию молекул белков или их специфическое взаимодействие с другими белками. R-белки, находящиеся в незараженной клетке в виде мономеров, с участием своих LZ-доменов могут формировать гомо- или олиго-димеры, взаимодействующие с элиситором, что проявляется в виде «окаймленных» ямок на плазмалемме, либо, наоборот, при заражении происходит диссоциация уже имевшихся олигомеров. Возможны также гетероди- и поли-меризация R-белка с другими белками [23].

• Вариабельный N-концевой участок белковой молекулы. Он может быть сайтом, гомологичным домену Toll-белка дрозофилы и рецептору интерлейкина (IL-1) человека и называемым TIR (Toll–Interleukin-1 Resistance), либо спирально-закрученным (Coiled-Coile – CC) доменом [182,183].

Известно, что рецепторный белок Toll контролирует дорзо-вентральную поляризацию эмбрионов дрозофилы, а также играет роль в ядерной локализации фактора Dif (Dorsal-related immunity factor), который активирует защитные свойства жирового тела. В частности, белок Toll регулирует синтез антигрибного пептида дрозофилы – дрозомицина [100].

Интерлейкин-1 – один из важнейших цитокинов (т.е. межклеточных передатчиков иммунной системы высших животных и человека), активирующих иммунокомпетентные клетки, благодаря взаимодействию с находящимися на поверхности этих клеток рецепторами. Связывание обоих рецепторных белков сопровождается активацией серин/треониновых киназ. Возможно, что и TIR-участки растительных R-белков имеют сходные функции.

У злаков и других однодольных в составе R-генов TIR-домен не обнаруживается, а если и выявляется, то вне связи со структурой LRR–NBS. У однодольных TIR-домен, как правило, замещается CC-участком [179].

• Участок серин/треониновых фосфокиназ (Protein Kinase – PK), имеющийся у некоторых R-белков. Он обладает отчетливыми сигнальными свойствами и является фактором активации транскрипции [184,188]. PK-участок R-белков обычно находится на цитоплазматической стороне плазмалеммы и либо связан, либо не связан с участками R-белков, расположенными над или под поверхностью плазматической мембраны. У некоторых R-белков PK-сайт отсутствует вообще

R-белки 1 группы имеют внеклеточный LRR-гликопротеиновый домен, заякоренный в плазматической мембране С-концом молекулы. N-концевой участок молекулы R-белков – их свободный LRR-конец, может быть непосредственным сайтом связывания элиситоров, но он не способен выполнять функцию передачи сигнала с поверхности на внутрицитоплазматические домен и далее на ядро [186]. Часто LRR-участки ассоциируются с мембранными протеинкиназами вне молекулярной структуры R-белков: в частности, их короткий С-концевой домен на внутренней стороне плазмалеммы может взаимодействовать с киназами [184].

R-белки 2 группы, такие как продукт гена Pto, напротив, являются внутриклеточными серин/треониновыми киназами, но они не выполняют рецепторной функции, т.к. у них отсутствует экстраплазматический участок. Доставку элиситора AvrPto в цитоплазму клетки растений обеспечивает III тип секреции у бактерий.

R-белки 3 группы – например, белок риса Ха21 – единственный из изученных R-белков, который полностью соответствует требуемым функциональным (рецепторным и сигнальным) параметрам. В нем наружу выдвинута рецепторная LRR-часть, а внутри клетки находится участок, имеющий структуру серин/треониновой протеинкиназы, – т.е. способный к внутриклеточной трансдукции сигнала.

R-белки 4 и 5 групп имеют области рецепции и трансдукции сигнала, но полностью внутриклеточная локализация этих белков не соответствует представлениям о над- или и под-мембранной локализации рецепторных и иных участков.

В настоящее время установлено, что распознавание чужеродных молекул может быть как прямым при физическом контакте Avr- и R-белков на поверхности клетки, так и непрямым после проникновения эффектора внутрь клетки [188].

Ранее структура R-генов растений, где главные домены рецепторов находятся не на поверхности плазмалеммы, а внутри цитоплазмы, вызывала недоумение. Для вирусов, белки которых синтезируются внутри клеток хозяина, внутриклеточная локализация продуктов R-генов еще объяснима, но как бактериальные клетки переносят свои Avr-белки под стенку и плазмалемму, где узнаются соответствующими R-белками? Пути доставки эффекторов патогенов в клетки растения долго оставались непонятными.

Впоследствии у грам-негативных бактерий была обнаружена способность к доставке эффекторов внутрь цитоплазмы хозяина посредством пилей [156-158]. В патосистемах гриб–растение вопрос о способах доставки эффекторных молекул патогенов к их рецепторам внутрь клеток хозяина и о прямом/непрямом взаимодействии продуктов Avr и R генов дискутировался в литературе, и было сделано предположение, что у патогенных грибов имеется некий аналог секреторного механизма бактерий [161,173]. Ученые склонны думать, что этот механизм обусловлен или тесно связан с процессами цитоза на поверхности клеток [170,189].

Однако в фитопатосистемах, вызываемых Cladosporium fulvum, Tiletia caries и некоторыми другими грибами, четких признаков цитоза не выявлено. Возможно, что у томата имеется неспецифический рецептор, связывающий внеклеточные белки грибного патогена без индукции сверхчувствительности [162].

Узнавание с эндоцитозным поглощением эффекторов и участием киназ происходит в ряде фитопатосистем, образуемых некротрофами [55,166,190,191].

В фитопатосистемах, создаваемых биотрофами, имеющиеся данные указывают на то, что специфическая стадия взаимодействия и акт межклеточного распознавания происходит в период формирования гаусториев, которые вступают в контакт с плазматической мембраной клетки хозяина и что это взаимодействие связано также с активацией процессов эндо- и экзоцитоза [29,62,97,161,174,192].

В отличие от рецепции неспецифических элиси­торов, многие R-белки не связаны с плазматической мембраной, поэтому специфические элиситоры могут войти в контакт с ними только с помощью каких-то особых механизмов, типа секреции III типа бактерий. В основном для рецепции элиситоров необходима предварительная димеризация или гетеромеризация LRR области R-белка [100].

Сигнальные системы, оперирующие внутри растительной клетки, начинают функционировать с момента контакта патогена или его элиситора с рецептором, чаще всего находящимся на цитоплазматической мембране, и завершаются за­щитным ответом растительной клетки. Большинство неспецифических элиситоров связываются с внешним участком рецепторов, находящихся на плазмалемме, что вызывает автофосфорилирование и изменение конформации рецепторов. После этого остаток фосфорной кислоты передает­ся на внутренний участок рецептора, активируя ассоциированный с ре­цептором фермент [184,186,193,194].

Рецептор, вне зависимости от природы связывающегося с ним эффек­тора, имеет общий план строения: участок, расположенный вне клетки, внутримембранный участок и участок, погруженный в цитоплазму. Внеш­ний и внутренний участки рецептора являются вариабельными, его сре­динная часть – константной. Наружный N-конец рецептора специфичен к элиситору, тогда как внутренний С-конец – к ассоциированному с рецеп­тором ферменту. Последнее и определяет, с какой из сигнальных систем будет осуществляться взаимодействие.

В акте распознавания на цитоплазматической стороне плазмалеммы кроме рецепторов, непосредственно взаимодействующих с элиситорами, принимают участие и некоторые соседние белки – такие как EDS1/EDR1 (с активностью липазы); RAR1/NDR1 (RAR1 играет роль якоря для групп гликозилфосфатидилинозитола (GPI) и требуется, в частности, для запуска Mla1– гена устойчивости злаков к мучнистой росе и NDR1 – гена нерасоспецифической болезнеустойчивости; SGT1/SKP1 (SGT1 – суппрессор G2-аллеля SKP1, явдяющегося связанным белком S-фазы киназы); PAD4/Hsp (PAD – фитоалексин-дефицитный белок с липазной активностью, Hsp – белок теплового шока, шаперон) [100]. Эти и некоторые другие белки вносят свой вклад либо в рецепцию элиситора патогена, либо в передачу сигнала с плазмалеммы на ядро, могут снижать силу стимула и скорость передачи сигнала по цепи фосфокиназ, регулируя таким образом ответную реакцию клетки растения от сверхчувствительной устойчивости до восприимчивости.

Немногие R-белки связаны с мембраной и содержат трансмембранный сайт, большинство же находится в цитоплазме, но есть и локализованные в ядре (N-белки, определяющие устойчивость к вирусу табачной мозаики, или MLA10 –фактор устойчивости к мучнистой росе). Эти белки содержат транскрипционный белковый фактор WRKY, и становится возможна рецепция эффектора, которая без промежуточных киназ приводит к регуляции экспрессии ядерных генов [194,195].

В целом процесс можно представить следующим образом. При взаимодействии эффекторов патогена с рецепторами плазмалеммы растения происходит связывание и втягивание этих рецепторов в ямках на плазматической мембране вглубь цитоплазмы, где они, замыкаясь в везикулы, сливаются с другими налипающими пузырьками, содержащими мономерные и полимерные углеводы, фенольные соединения различной степени сложности и структуры, гидролитические и окислительные ферменты и другие вещества, и одновременно – активация связываю-щих Avr-белки рецепторов плазмалеммы, сопровождаемая выделением K+ и H+ (и подкислением экстраплазматического пространства), входом Ca2+ в цитоплазму, где ионы активируют имеющиеся на цитоплазматической стороне плазмалеммы протеинкиназы в результате сложного ступенчатого каскада фосфорилирования белков [29,193,194]. В передаче сигнала с активированного рецептора на ядро, помимо каскада фосфокиназ, участвуют еще WRKY-факторы и некоторые другие [195,196]. На пути распространения сигналов функционируют десятки различ­ных протеинкиназ и фосфопротеинфосфатаз, которые регулируют степень фосфорилирования белков и тем самым их активность. В клеточных белках происходит избирательное фосфорилирование свободных боко­вых ОН-групп остатков серина, треонина или тирозина [197]. Фосфо­рилирование осуществляют протеинкиназы, использующие АТФ в качестве доноров фосфата.

Многие из известных на сегодняшний день вторичных мессенджеров действуют при посредстве ключевых молекул особого класса, которые и направляют поток сигналов от рецепторов внутрь клетки. Эти, передающие сигнал белки, регулируются гуаниловыми нуклеотидами, откуда и их название – G-белки [187].

Активация клеточного сигнала происходит, как правило, после взаимодействия элиситора с гетеродимером, состоящим из R-белка и протеинкиназы (т.к. с плазматической мембраной связано несколько типов киназ). Если этому процессу не мешают развиваться, он приводит к передаче сигнала с поверхности плазматической мембраны на ядро, активации определенных участков хроматина и включению сверхчувствительного некроза инфицируемой клетки – программы ее быстрого самоуничтожения, в ином случае – к развитию той или иной степени совместимости [29,65,66,72,172,198-201].

Однако многие детали всего механизма взаимодействия пока не ясны.